絕對定量翻譯組Ribosome-seq建庫方法技術

本發明專利技術公開了一種絕對定量翻譯組Ribosome

【技術實現步驟摘要】
絕對定量翻譯組Ribosome
?
seq建庫方法


[0001]本專利技術涉及生命科學
，具體而言，涉及一種絕對定量翻譯組Ribosome
?
seq建庫方法。

技術介紹

[0002]在生命的各個領域中，蛋白質都是由核糖體在翻譯過程中合成的。翻譯調節占整個調控幅度的54％，超過了轉錄、mRNA降解和蛋白質降解之和。因此，有必要在全局范圍內對翻譯進行研究。與其他“組學”方法一樣，翻譯組學研究翻譯過程中的所有成分，包括但不限于翻譯mRNAs、核糖體、tRNAs、調節性RNA和新生多肽鏈。近年來的技術進步在全球范圍內對這些成分的研究取得了突破性進展，包括它們的組成和動力學。這些方法已被應用于越來越多的研究中，以揭示翻譯控制的多個方面。翻譯的過程并不局限于將mRNA編碼序列轉化為多肽鏈，它還以一種精細而敏感的方式控制蛋白質組的組成。因此，翻譯組學在蛋白質組學、癌癥研究、細菌應激反應、生物節律性和植物生物學等領域都具有獨特的創新能力。
[0003]翻譯組學的研究是指正在翻譯的RNA分子的高通量分析技術的泛稱，常用的翻譯組學研究方法是基于核糖體印跡分析(Ribosome Profiling)進行高通量測序分析。而Ribo
?
seq即是目前翻譯組學研究的主流方法，其具體方法是用低濃度RNase處理核糖體
?
新生肽鏈復合物，降解掉無核糖體覆蓋的RNA片段，再去除核糖體，最后利用二代測序技術檢測被核糖體保護的約～30bp的正在翻譯RNA小片段。這些被核糖體保護的RNA片段，準確指示了核糖體正在進行翻譯的“足跡”，因此這些被核糖體保護的RNA片段，又被稱為核糖體足跡(ribosome footprints，簡稱RPFs)。相比傳統的轉錄組測序(RNA
?
seq)，Ribo
?
seq的關鍵特點是：只針對與核糖體結合，長度約為28
?
30nt，正在被翻譯的RNA片段進行富集、測序和定量。由于RFs直接代表正在被翻譯的序列，因此對RFs進行測序，可以精確告訴我們細胞中蛋白翻譯的豐富信息(包括翻譯區域、翻譯豐度、翻譯速率等)。
[0004]在二代測序技術中的建庫及測序環節，通常需要進行一定次數的PCR擴增，以滿足測序所需的文庫量。然而，由于擴增的偏好性以及擴增倍數的不確定性(在PCR擴增時，所有的文庫片段并非以同等速率等量的擴增，擴增速率受到片段長度、GC含量、片段濃度等多方面的影響，容易擴增的片段極大的被富集，一些含量較低的片段或堿基偏好嚴重的片段甚至完全丟失，最終影響測序結果的準確性)，導致各個片段被擴增的倍數是不一定相同的，這種因PCR擴增產生的重復reads即為Duplication。Duplication存在會導致后續分析中各個基因表達量和真實情況不一致，降低了結果的可信度。

技術實現思路

[0005]本專利技術旨在提供一種絕對定量翻譯組Ribosome
?
seq建庫方法，以提高檢測出與核糖體結合的mRNA信息的準確性，提高Ribo
?
seq建庫數據質量。
[0006]為了實現上述目的，根據本專利技術的一個方面，提供了一種絕對定量翻譯組Ribosome
?
seq建庫方法。該建庫方法包括以下步驟：S1，對待測樣品中的核糖體構象進行固
定，對待測樣品進行裂解，收集裂解產物；S2，利用酶切及分子排阻色譜法對裂解產物進行RPF的分離和提取，獲得RNA樣品；S3，去除RNA樣品中的rRNA；S4，對去除rRNA后的RNA樣品進行5
’
磷酸化反應；S5，利用磷酸化后的RNA樣品構建得到翻譯組Ribosome
?
seq絕對定量RNA測序文庫。
[0007]進一步地，S1中，采用放線菌酮對待測樣品中的核糖體構象進行固定。
[0008]進一步地，待測樣品來源于植物、動物或微生物；和/或，待測樣品為植物、動物的組織、細胞、組織裂解物或細胞裂解物。
[0009]進一步地，S1包括：對待測樣本進行組織研磨、放線菌酮對核糖體構象進行固定、細胞清洗、細胞收集以及細胞裂解得到裂解產物，并進行質檢的步驟。
[0010]進一步地，S2包括，向裂解產物中加入核糖核酸酶I，室溫混勻孵育，然后加入RNA酶抑制劑，終止酶切反應。
[0011]進一步地，S2中，采用微型層析分離柱層析柱進行分離純化RPF。
[0012]進一步地，S5中在還構建絕對定量RNA測序文庫之前還包括：使用Qubit檢測磷酸化后的RNA樣品的核酸RPF濃度，RPF的濃度應≥40ng/μl，總量應≥1ug，滿足建庫條件，則進行構建絕對定量RNA測序文庫；若核酸RPF濃度在40
?
20ng/μl，總量在1ug>M≥500ng，則嘗試風險建庫；若核酸RPF濃度低于20ng/μl，總量低于500ng，則重新進行RNA樣本提取。
[0013]進一步地，S3包括：S3.1，于無核酸酶的微量離心管中，用無核酸酶的水將RNA樣品稀釋，冰上放置備用，并將RNA樣品與探針雜交，用移液器吹打混勻，并轉瞬離心將樣品收集至管底，將樣品置于PCR儀中進行反應，然后瞬時離心將樣品收集至管底，并置于室溫；S3.2，向S1的產物中加入去核糖核酸磁珠吹吸混勻，階段性震蕩；S3.3，將S2的產物置于磁力架上靜置5min，轉移上清至新的微量離心管中，置于磁力架上靜置1min，轉移上清至新的無核酸酶的EP管中，冰上放置。
[0014]進一步地，S4包括：S4.1，配置5
’
磷酸化反應體系；S4.2，將上述配制好的5
’
磷酸化反應體系放置在PCR儀中，37℃反應60分鐘，70℃反應10分鐘；S4.3，將S4.2的產物進行純化回收。
[0015]進一步地，S5中構建絕對定量RNA測序文庫包括：依次進行3
’
接頭連接，5
’
接頭連接，反轉錄，磁珠純化，PCR擴增，磁珠純化，回收目的片段，文庫定量及進行質檢；優選的，PCR擴增包括UMI及index擴增。
[0016]應用本專利技術的技術方案，可以以植物、動物或微生物為樣本，優選利用cycloheximide進行核糖體構像固定，通過酶切及分子排阻色譜法分離核糖體包裹的mRNA、然后去除rRNA、進行5
’
磷酸化反應、絕對定量文庫構建及庫檢，該技術方案在獲取RPF后通過構建絕對定量文庫，將文庫構建過程及上機測序過程中產生的PCR dup進行精準去除，與常規的小片段文庫相比，具有定量更準，序列測序更準，低拷貝序列定量更準的優勢，確保RPF定量結果無偏差，能夠為翻譯組學進行深入精準的研究提供可靠的數據結果。
附圖說明
[0017]構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本專利技術的進一步理解，本專利技術的示意性實施例及其說明用于解釋本專利技術，并不構成對本專利技術的不當限定。在附圖中：
[0本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種絕對定量翻譯組Ribosome
?
seq建庫方法，其特征在于，包括以下步驟：S1，對待測樣品中的核糖體構象進行固定，對所述待測樣品進行裂解，收集裂解產物；S2，利用酶切及分子排阻色譜法對所述裂解產物進行RPF的分離和提取，獲得RNA樣品；S3，去除所述RNA樣品中的rRNA；S4，對去除rRNA后的RNA樣品進行5
’
磷酸化反應；S5，利用磷酸化后的RNA樣品構建得到翻譯組Ribosome
?
seq絕對定量RNA測序文庫。2.根據權利要求1所述的絕對定量翻譯組Ribosome
?
seq建庫方法，其特征在于，所述S1中，采用放線菌酮對所述待測樣品中的核糖體構象進行固定。3.根據權利要求1所述的絕對定量翻譯組Ribosome
?
seq建庫方法，其特征在于，所述待測樣品來源于植物、動物或微生物；和/或，所述待測樣品為植物、動物的組織、細胞、組織裂解物或細胞裂解物。4.根據權利要求1所述的絕對定量翻譯組Ribosome
?
seq建庫方法，其特征在于，所述S1包括：對所述待測樣本進行組織研磨、放線菌酮對核糖體構象進行固定、細胞清洗、細胞收集以及細胞裂解得到所述裂解產物，并進行質檢的步驟。5.根據權利要求1所述的絕對定量翻譯組Ribosome
?
seq建庫方法，其特征在于，所述S2包括，向所述裂解產物中加入核糖核酸酶I，室溫混勻孵育，然后加入RNA酶抑制劑，終止酶切反應。6.根據權利要求1所述的絕對定量翻譯組Ribosome
?
seq建庫方法，其特征在于，所述S2中，采用微型層析分離柱層析柱進行分離純化RPF。7.根據權利要求1所述的絕對定量翻譯組Ribosome
?
seq建庫方法，其特征在于，所述S5中在構建絕對定量RNA測序文庫之前還包括：使用Q...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉志靜，惠遠遠，周勛，
申請(專利權)人：天津諾禾醫學檢驗所有限公司，
類型：發明
國別省市：