一種用于基因靶向與表達(dá)的AAV-8型血清型的改造型載體及其構(gòu)建方法及應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種用于基因靶向與表達(dá)的腺相關(guān)病毒(AAV)8型血清型(AAV

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種用于基因靶向與表達(dá)的AAV
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8型血清型的改造型載體及其構(gòu)建方法及應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)屬于基因工程和生物
，具體涉及一種用于基因靶向與表達(dá)的AAV
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8型血清型的改造型的篩選、構(gòu)建及應(yīng)用。

技術(shù)介紹

[0002]AAV是一種有DNA缺陷的非致病性細(xì)小病毒，重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，具有免疫原性弱、安全性好、宿主范圍廣、感染效率高且組織特異性強(qiáng)，是理想的基因表達(dá)載體，已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于臨床實(shí)驗(yàn)。
[0003]目前AAV病毒包裝系統(tǒng)中使用AAV病毒外殼蛋白，較多使用的是傳統(tǒng)的野生型的AAV1、2、5、8和9型外殼蛋白，并且具有不同的組織或細(xì)胞的特異性。這類天然野生型AAV病毒外殼，雖然能夠?qū)AV有效地靶向目的組織進(jìn)行外源基因的表達(dá)，如AAV1可以高效感染骨骼肌細(xì)胞，AAV2能夠感染視網(wǎng)膜細(xì)胞，AAV8型可將外源基因高效傳遞至肝細(xì)胞，AAV9具有跨血腦屏障的能力并將外源基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及腦部表達(dá)等等。病毒的天然親嗜性決定了靶向傳遞治療的基礎(chǔ)，另一方面也為我們改造這些病毒外殼，使其具有更高的滲透能力，更持久的表達(dá)時(shí)間以及更低的免疫原性提供了平臺(tái)。
[0004]鑒于AAV已被廣泛運(yùn)用于各類疾病的臨床前研究，當(dāng)務(wù)之急是針對(duì)天然野生型AAV外殼蛋白的靶向性改造修飾與優(yōu)化。目前，用于AAV衣殼蛋白進(jìn)行改造優(yōu)化的方法有很多，包括DNA shuffling技術(shù)、衣殼蛋白氨基酸定點(diǎn)突變和人工插入、刪除氨基酸序列改造衣殼蛋白修飾等等。其中，近年來(lái)發(fā)展而來(lái)的基于噬菌體展示系統(tǒng)技術(shù)，從隨機(jī)肽段庫(kù)中篩選特異靶向的短肽段插入野生型AAV外殼蛋白的特定位點(diǎn)，是一種高效，可行的篩選方法。
[0005]AAV介導(dǎo)的眼科疾病的治療，在臨床上具有很廣闊的運(yùn)用前景，其優(yōu)勢(shì)在于眼球組織結(jié)構(gòu)清晰、具有透明的屈光間質(zhì)，易于觀察、定位和操作。此外眼球組織還具有免疫赦免性即不易排斥外來(lái)物質(zhì)的特質(zhì)，例如腺病毒(AdV)、腺相關(guān)病毒(AAV)病毒等，使得病毒不論是單一基因還是多基因治療眼部疾病的可行性都極具潛力。流行病學(xué)資料表明，世界各地大多數(shù)人感染過(guò)野生型AAV，剛出生的嬰兒體內(nèi)就已存在AAV2抗體，因此AAV2較易引起人體自身免疫反應(yīng)及獲得性免疫反應(yīng)，而AAV8最初是從恒河猴中分離出來(lái)的，在血清學(xué)上比較獨(dú)特，與其他血清型的交叉反應(yīng)最小，免疫原性要比AAV低得多。在許多眼科疾病中，病人的視網(wǎng)膜通常是比較脆弱的，因此臨床實(shí)踐中往往通過(guò)玻璃體注射藥物的方式而不是視網(wǎng)膜下腔的注射方式進(jìn)行感染。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，野生型AAV8在眼內(nèi)玻璃體向視網(wǎng)膜等眼后段的傳遞效率比較弱，并且在實(shí)際眼科疾病臨床運(yùn)用中也發(fā)現(xiàn)。因此我們擬用定向進(jìn)化的方法，將7個(gè)隨機(jī)氨基酸片段及3個(gè)保護(hù)氨基酸，總共10個(gè)氨基酸，一同插入AAV
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8型野生型外殼的第590
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591位氨基酸之間，插入隨機(jī)短肽展示庫(kù)，并通過(guò)體外表達(dá)的方法在目的組織中篩選出隨機(jī)短肽庫(kù)中迅速有效篩選出能夠通過(guò)玻璃體注射感染到視網(wǎng)膜的穿透性好，感染性強(qiáng)，免疫原性低的新型AAV改造型外殼。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0006]本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是篩選一種用于基因靶向與表達(dá)的AAV
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8型血清型的改造型載體。
[0007]本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供該改造型載體的構(gòu)建方法。本專利技術(shù)通過(guò)眼球玻璃體注射，篩選到一個(gè)能感染到視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的新型AAV
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8改造型外殼AAV8
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590RGD。即通過(guò)使用體外進(jìn)化篩選的方法，在AAV
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8野生型外殼的第590位氨基酸和第591外氨基酸之間插入10個(gè)氨基酸，其中包括7個(gè)隨機(jī)氨基酸、5
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端2個(gè)保護(hù)氨基酸LA和3
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端1個(gè)保護(hù)氨基酸A。經(jīng)過(guò)兩步病毒包裝，使得每個(gè)AAV病毒外殼只帶有獨(dú)特唯一的10個(gè)氨基酸序列插入，并對(duì)應(yīng)其AAV的基因組序列，將這一病毒注射在小鼠的玻璃體中，約1周后取小鼠的視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜，提取并分析其基因組，觀察是否有AAV病毒從玻璃體滲透到視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜色素上皮層。
[0008]本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供該改造型載體AAV8
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590RGD的應(yīng)用。
[0009]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：
[0010]在本專利技術(shù)的第一方面，提供一種用于基因靶向與表達(dá)的AAV
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8型血清型的改造型載體，在如SEQ ID NO.2所示的AAV
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8型血清型外殼蛋白的第590位氨基酸與第591位氨基酸之間插入如SEQ ID NO.3所示的10個(gè)氨基酸序列:LARGDSTKSA,其中第1、第2和第10位的氨基酸為保護(hù)氨基酸，第3至第9位氨基酸為篩選獲得的氨基酸序列。
[0011]所述如SEQ ID NO.3所示的10個(gè)氨基酸序列，其對(duì)應(yīng)的堿基序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]所述用于基因靶向與表達(dá)的AAV
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8型血清型的改造型載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]所述改造型載體插入的氨基酸序列LARGDSTKSA用于AAV病毒包裝用的外殼，或者用于生物大分子、抗體藥物、肽段和化學(xué)小分子的連接及靶向。
[0014]本專利技術(shù)構(gòu)建含有對(duì)應(yīng)如SEQ ID NO.3所示的10個(gè)氨基酸序列(7個(gè)隨機(jī)氨基酸序列及3個(gè)保護(hù)氨基酸)的30個(gè)堿基序列的AAV載體，包括CAP基因、REP基因，選擇性的標(biāo)記Ampicillin抗性基因；在所述CAP蛋白的第590位氨基酸與第591位氨基酸對(duì)應(yīng)的堿基之間插入如SEQ ID NO.4所示的相對(duì)應(yīng)的30個(gè)堿基。Ampicillin抗性基因即抗生素抗性基因，其目的是使成功導(dǎo)入載體的細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性，從而能夠篩選并擴(kuò)增AAV載體。
[0015]在本專利技術(shù)的第二方面，還提供上述載體的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟：
[0016]第一步，合成隨機(jī)的21個(gè)堿基以及在5
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端和3
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端添加保護(hù)堿基TTGGCT和GCC，插入AAV
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8Cap基因的第590位和591位氨基酸對(duì)應(yīng)的堿基序列之中，形成AAV外殼載體；
[0017]第二步，將上述AAV外殼載體，電擊轉(zhuǎn)化若干個(gè)感受態(tài)，每個(gè)感受態(tài)在Luria
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Bertani(LB)培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，次日于每個(gè)培養(yǎng)基中取菌液混合接種于LB培養(yǎng)基搖菌過(guò)夜，剩余菌液甘油保存(隨機(jī)片段庫(kù))；質(zhì)粒抽提，得到混合載體庫(kù)，命名為pAAV8
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590
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7aa。
[0018]第三步，pAAV8
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590
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7aa與AAV
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8Cap質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒一起進(jìn)行AAV病毒包裝、純化，此病毒命名為AAV library transfer shuttles，與腺病毒一起共感染He本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于基因靶向與表達(dá)的AAV
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8型血清型的改造型載體，特征在于：在如SEQ ID NO.2所示的AAV
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8型血清型外殼蛋白的第590位氨基酸與第591位氨基酸之間插入如SEQ ID NO.3所示的10個(gè)氨基酸序列:LARGDSTKSA,其中第1、第2和第10位的氨基酸為保護(hù)氨基酸，第3至第9位氨基酸為篩選獲得的氨基酸序列。2.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述如SEQ ID NO.3所示的10個(gè)氨基酸序列，其對(duì)應(yīng)的堿基序列如SEQ ID NO.4所示。3.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述用于基因靶向與表達(dá)的AAV
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8型血清型的改造型載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述改造型載體插入的氨基酸序列LARGDSTKSA用于AAV病毒包裝用的外殼，或者用于生物大分子、抗體藥物、肽段和化學(xué)小分子的連接及靶向。5.如權(quán)利要求1
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4任一項(xiàng)所述的改造型載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：第一步：合成隨機(jī)的21個(gè)堿基，并在5
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端和3
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端添加保護(hù)堿基TTGGCT和GCC，并插入AAV
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8Cap基因的第590位和591位氨基酸對(duì)應(yīng)的堿基序列之中，形成AAV外殼載體；第二步，將上述AAV外殼載體，電擊轉(zhuǎn)化若干個(gè)感受態(tài)，每個(gè)感受態(tài)在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，次日于每個(gè)培養(yǎng)基中取菌液混合接種于LB培養(yǎng)基搖菌過(guò)夜，剩余菌液甘油保存；質(zhì)粒抽提，得到混合載體庫(kù)，命名為pAAV8
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590
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7aa；第三步，pAAV8
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590
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7aa與AAV
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8Cap質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒一起進(jìn)行AAV病毒...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張仕卿，吳小江，顧莉萍，余虹，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海目鏡生物醫(yī)藥科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：