可調轉座子系統技術方案

本發明專利技術提供了以藥物可誘導的方式增強哺乳動物細胞系的蛋白生產的方法和系統。本文所述的方法可以用于產生蛋白生產細胞系，其中編碼目的蛋白產物的基因被插入細胞基因組內的特定安全港基因座(SHL)，并且通過使用抗生素誘導劑來誘導基因拷貝數擴增。該方法能夠條件性地活化藥物可誘導的轉座酶。本文描述的藥物可誘導的基因擴增方法有效地起到分子調節盤的作用：將藥物可誘導的同源重組和條件性基因活化組合，以細調哺乳動物系統中的基因擴增。以細調哺乳動物系統中的基因擴增。以細調哺乳動物系統中的基因擴增。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】可調轉座子系統


[0001]本專利技術屬于生物表達系統領域。方面包括通過轉座子將外源基因可控地并入表達宿主細胞中的系統。系統包括聯合起作用以控制轉座子介導的基因插入位置、控制基因拷貝數和為細胞提供遺傳穩定性的特征。所述系統和相關方法允許用快速起作用的分子信號打開或關閉功能。

技術介紹

[0002]基于蛋白的產品已成為治療人疾病的重要生物藥物。這些藥物主要工程改造成由哺乳動物細胞系生產，因為這些細胞常常產生大量具有影響效能和免疫原性的適當關鍵質量屬性（CQA）的治療性蛋白。高容量生產力、產品滴度和穩定性是獲得蛋白治療劑的有效生產的重要標準。這些特征可能由變化的組合導致，所述變化共同使宿主系統成為一個蛋白高產者。這些屬性包括高翻譯效率、基因拷貝數、分泌能力、生長能力、在最大細胞密度下的存活時間以及翻譯后修飾。迄今為止，已經如下實現蛋白生產的改善：通過培養基和生物工藝優化，諸如給料策略和工藝參數控制，它們都是耗時的并且需要根據經驗確定。通過基因擴增使生產力最大化的基因組工程改造工具也在應用中（Fischer, 2015）。用于擴增目的基因的現有技術缺乏對被擴增的基因拷貝數的精確控制，缺乏對擴增基因的基因插入位置的控制，并且缺乏可預測的遺傳和細胞系穩定性。本專利技術涵蓋了四個關鍵的合乎需要的屬性，它們包括例如，目的基因的拷貝數的控制，向宿主細胞基因組中的插入位點的控制，向宿主細胞基因組中的插入位點的靶向放置，以及插入的基因的遺傳穩定性以獲得一致的生產力。
[0003]插入的基因的遺傳穩定性是該領域的一個主要擔憂。傳統上，為了產生具有目的蛋白的高生產力水平的CHO細胞系，通過使用細胞毒性的藥物誘導的基因擴增方法進行插入的基因的基因拷貝擴增，該方法涉及在遞增濃度的甲氨蝶呤（MTX）的選擇壓力下擴增和選擇二氫葉酸還原酶（DHFR）基因的高拷貝數。由于MTX是DHFR的抑制劑，僅具有高DHFR拷貝數的那些細胞才能存活。這種DHFR/MTX方法已被廣泛用于抗體的制造。谷氨酰胺合成酶（GS）/氨基亞砜蛋氨酸（sulfoxamine）（MSX）系統類似于DHFR/MTX系統。GS酶催化從谷氨酸鹽和氨生成谷氨酰胺。氨基亞砜蛋氨酸與GS酶結合并阻止谷氨酰胺的產生。當細胞遇到遞增濃度的MSX時，就會發生基因擴增。DHFR/MTX和GS/MSX方法的一個缺點是勞動密集型，并且獲得高產克隆需要重復的選擇和克隆周期，每個連續周期可能需要3
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4個月。此外，通過這些方法獲得的高產克隆通常是不穩定的，并且隨著細胞培養時間的推移，表現出蛋白合成的迅速減少。解決遺傳不穩定性的方法包括使用哺乳動物復制起始區（IR）和基質附著區。與DHFR/MTX或GS/MSX系統相比，這已經被證實會產生穩定的克隆。IR/MAR系統是一種基于使用攜帶哺乳動物復制起始區（IR）和基質附著區（MAR）的質粒的基因擴增方法，這導致在轉染的細胞中基因擴增的自發啟動，并已經與DHFR/MTX聯合使用以產生穩定的生產性細胞系（Noguchi, 2012）。IR/MAR和GS/MSX系統都能為產生遺傳上穩定的克隆細胞系選擇和代際提供勝過DHFR/MTX的在時間上的改善，但兩個系統都不能控制整合位點或基因拷貝
數。但是，所有三種描述的選擇方法都是費時費力的，缺乏對整合位點數和基因拷貝數的控制。在上述系統中，基因拷貝和整合位點數是一個純粹的隨機過程。
[0004]為了改進這些方法，基因擴增的一種替代形式是使用轉座元件（TE）。近年來，TE已經在轉基因的多位點整合方面表現出巨大希望，并且分子遺傳工具的可用性增強了TE的使用。根據其轉座機制，已經鑒定出兩類TE，它們可以被描述為復制并粘貼（I類TE）或剪切并粘貼（II類TE）。I類TE的復制分兩個階段：首先，它們從DNA轉錄到RNA，并然后將產生的RNA逆轉錄為DNA。然后將該復制的DNA隨機插入基因組的新位置。逆轉錄步驟由逆轉錄酶催化，所述逆轉錄酶常常由TE本身編碼。這些I類TE也被稱為逆轉錄轉座子。相比之下，II類TE的“剪切并粘貼”轉座機制不涉及RNA中間體，但需要轉座酶和反向末端重復序列（ITR）。轉座由幾種轉座酶催化。一些轉座酶非特異性地結合到DNA中的任何靶位點，而另一些轉座酶結合到特定的靶序列。轉座酶在靶位點處產生交錯切口從而產生粘性末端，切出DNA轉座子并將其連接進靶位點。DNA聚合酶填補從粘性末端產生的缺口，并且DNA連接酶關閉糖
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磷酸主鏈。這導致靶位點復制，使得DNA轉座子的插入位點可以通過短的直接重復序列（DNA聚合酶填充的靶DNA中的交錯切口）和隨后的反向末端重復序列（ITR）來識別，ITR對轉座酶切除TE而言是重要的。表1對比了目前使用的基因擴增方法，總結了轉座子方法的優點以及與其它基因擴增方法的差異。
[0005]表1. 基因擴增技術對比 DHFR/MTXGS/MSXIR/MAR轉座子最大拷貝數10101050擴增時間>6
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9個月1
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2個月1
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2個月1
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2個月拷貝數的控制否否否否整合的控制否否否否優先靶向安全港基因座(SHL)否否否是穩定性極少數穩定克隆極少數穩定克隆極少數穩定克隆極少數穩定克隆藥物誘導能力否否否是
DHFR/MTX：二氫葉酸/甲氨蝶呤；GS/MSX：谷氨酰胺合成酶/氨基亞砜蛋氨酸；IR/MAR：起始區/基質附著區。
[0006]轉座子允許大轉基因的包裝和穩定整合。但是，目前這項技術存在局限性。轉座過程以隨機方式發生，導致轉基因隨機整合。雖然存在熱點整合位點，但轉座子也可能整合到發育相關基因、轉錄調節基因、超增強子和癌基因或參與細胞代謝途徑的基因中，從而對生物制造造成安全擔憂(Balasubramanian, 2016)。此外，目前的轉座子技術對基因拷貝數和整合位點數的控制有限。表2總結了包括PiggyBac（EP2401376）、Leap
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In轉座酶（US9418767）和睡美人轉座酶（US7160682）在內的當前轉座子技術的特點及其局限性。還指出，遺傳穩定性是不受控制的。該表中未發現導致再切除事件和再整合事件的蛋白或mRNA的轉座酶遞送的低效率，所述事件也可以隨機發生，并可能促成觀察到的不一致遺傳穩定性。
[0007]表2. 轉座子技術對比 PiggyBacLeap
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In睡美人效率和滴度4
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11倍增加至多3倍增加效率不佳；至多10倍增加拷貝數的控制是否是
優先靶向安全港基因座(SHL)熱點存在于癌基因中未證實整合熱點優先于SHL克隆穩定性的概率低低低藥物誘導能力否否否無足跡編輯是是是運貨能力20kb未證實12kb轉座酶遞送mRNA/蛋白mRNA/蛋白mRNA/蛋白
盡管目前的轉座子技術比現有的DHFR/MTX、GS/MSX和IR/MAR基因擴增技術顯示出改善的遺傳穩定性，但仍然需要在基因插入方面具有更好的控制和預測性的技術。預測性的缺乏可能與基因組染色質狀態和染色質結構蛋白有關本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.用于表達宿主細胞中的基因拷貝數擴增的條件性控制系統，所述系統包含：1)核酸主調節構建體，其包含：在啟動子序列下游的相反取向的轉座酶序列，所述啟動子序列由誘導劑控制；由所述誘導劑控制表達的Cre重組酶序列；和，其中所述轉座酶序列在相反取向的異型第一Lox序列的上游和第二Lox序列的下游，所述第二lox序列在所述啟動子序列和所述轉座酶序列之間呈正向取向；且，其中終止序列被一對正向取向的lox序列括起來；2)表達轉座子核酸構建體，其包含：側接反向末端重復序列(ITR)的編碼目的蛋白序列的轉座子序列，所述ITR是所述轉座酶的結合靶標；和，在所述ITR上游的第一轉錄活化劑的結合位點(BS)；其中所述誘導劑的存在誘導Cre的表達，導致轉座酶的CRE/Lox倒位為正向取向并導致終止序列的切除，從而導致轉座酶的表達；使轉座子能夠插入目的的特定安全港基因座(SHL)處以表達目的蛋白。2.根據權利要求1所述的系統，其中所述轉座酶是睡美人轉座酶。3.根據權利要求1所述的系統，其進一步包含一種或多種呈配體/受體誘導劑形式的第二轉錄活化劑。4.根據權利要求3所述的系統，其中所述主調節控制構建體啟動子序列中的一個或多個是TRE3G啟動子，且所述誘導劑是多西環素/可逆四環素轉錄活化劑(Dox/rtTA)。5.根據權利要求1所述的系統，其中所述目的蛋白是抗體重鏈或抗體輕鏈。6.根據權利要求1所述的系統，其中所述宿主細胞選自：SP2/0、NS0、HEK293T、Vero和CHO。7.根據權利要求1所述的系統，其中所述轉座子的插入通過AAV和CRISPR酶Cas9、Cas12a (Cpf1)、Cas12b、CasX或CasY向一個或多個安全港基因座(SHL)中的敲入實現。8.根據權利要求7所述的系統，其中所述SHL選自表3的SHL。9.根據權利要求1所述的系統，其中所述主調節構建體和表達轉座子構建體在相同核酸上。10.根據權利要求1所述的系統，其中所述主調節構建體進一步包含控制可逆四環素轉錄活化劑(rtTA)的表達的泛素啟動子和選擇壓力抗性因子(例如，Bsd)。11.根據權利要求10所述的系統，其中所述泛素啟動子選自：與CMV即刻早期增強子元件組合的EF1a、CAG、Cbh、SV40、UBC、CMV、EFS和CMV啟動子。12.核酸主調節構建體...

【專利技術屬性】
技術研發人員：K，
申請(專利權)人：阿瑞迪思醫藥公司，
類型：發明
國別省市：