卒中檢測試劑盒及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種卒中檢測試劑盒及其應用，包括酶標反應板、檢測抗體、標準品、酶標親和素、檢測抗體稀釋液、樣品稀釋液、洗滌液、終止液、顯色液，其特征在于：所述檢測抗體為生物素標記的抗人組織激肽釋放酶單克隆抗體，所述標準品為尤瑞克林，所述酶標親和素為辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素。本發明專利技術在延用生物素

【技術實現步驟摘要】
卒中檢測試劑盒及其應用


[0001]本專利技術涉及人組織激肽釋放酶檢測
，具體地指一種卒中檢測試劑盒及其應用。

技術介紹

[0002]人組織激肽釋放酶(TK)是一類絲氨酸蛋白酶，能促進低分子激肽原釋放血管活性肽從而發揮一系列生物活性作用，命名為KLK1。國內外已有200多項研究探討了TK對腦卒中的治療價值。國內外的團隊分別通過多種心臟病例對照研究和大規模的橫斷面研究發現血漿中TK水平與卒中的發生及預后負相關，降低的血漿TK水平能預測缺血性卒中的風險，其靈敏性為87％，特異性為87％，正確指數為0.741。因此，建立一項TK水平快速檢測的試劑盒有助于卒中的診斷及預后的評估。
[0003]鑒于TK對腦卒中的預測及治療價值，申請人前期制備過TK檢測的雙抗體夾心ELISA試劑盒(CN101672851A)和活性檢測試劑盒(CN104049082A)。但是CN101672851A采用的是雙抗體夾心ELISA法，檢測步驟較多，耗時4.5小時，而不利于大批量檢測。CN104049082A檢測的是TK的活性，而樣品中的TK蛋白不易降解，但容易失活，因此也具有局限性。這兩項試劑盒耗時太久，方法復雜，不利于大批量檢測。

技術實現思路

[0004]針對上述現有技術存在的不足，本專利技術的目的在于提供一種卒中檢測試劑盒及其應用。本專利技術在延用生物素
?
親和素放大系統和特異性單抗的同時，引入已商品化的高純度標準品，同時優化檢測方法，將原來的4.5小時的檢測時間縮短到1.5小時，從而大量節省了人力成本，并提升了產品質量。
[0005]為達到上述目的，本專利技術通過下述技術方案實現：
[0006]一方面，本專利技術提供一種卒中檢測試劑盒，包括酶標反應板、檢測抗體、標準品、酶標親和素、檢測抗體稀釋液、樣品稀釋液、洗滌液、終止液、顯色液，其特征在于：所述檢測抗體為生物素標記的抗人組織激肽釋放酶單克隆抗體，所述標準品為尤瑞克林，所述酶標親和素為辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素。
[0007]優選地，檢測靈敏度為5
?
500nM。
[0008]優選地，所述洗滌液的pH值為7.4，濃度為0.15M，所述洗滌液由KH2PO4、Na2HPO4·
12H2O、NaCl、KCl、Tween
?
20和蒸餾水配制而成。
[0009]優選地，所述樣品稀釋液的pH值為9.6，濃度為0.05M，所述樣品稀釋液由Na2CO3、NaHCO3、牛血清白蛋白和蒸餾水配制而成。
[0010]優選地，所述檢測抗體稀釋液的pH值為7.4，濃度為0.15M，所述檢測抗體稀釋液由KH2PO4、Na2HPO4·
12H2O、NaCl、KCl和蒸餾水配制而成。
[0011]優選地，所述終止液濃度為2M，所述終止液由濃硫酸和蒸餾水配制而成。
[0012]優選地，所述顯色液由四甲基聯苯胺TMB、底物緩沖液和H2O2配制而成，所述底物緩
沖液為pH值為5.5的磷酸鹽檸檬酸溶液。
[0013]優選地，所述底物緩沖液由Na2HPO4、檸檬酸和蒸餾水配制而成。
[0014]另一方面，本專利技術提供一種卒中檢測試劑盒在檢測血漿中人組織激肽釋放酶含量的應用。
[0015]優選地，試劑盒在檢測血漿中人組織激肽釋放酶含量的方法，包括以下步驟：
[0016]1)倍比稀釋標準品，分別向反應板中加入標準品及1：100倍稀釋的血漿；
[0017]2)加入1:2000倍稀釋的檢測抗體，于室溫搖床上360轉/分鐘，反應60分鐘；
[0018]3)加入1：2000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素，反應25分鐘，TMB顯色終止并讀數；
[0019]4)結果判斷，空白調零，讀取450nm波長處吸光度，繪制標準曲線；
[0020]5)計算結果，根據標準曲線計算出血漿中人組織激肽釋放酶的含量。
[0021]本專利技術與現有技術相比，具有如下優點及有益效果：
[0022]本專利技術在延用生物素
?
親和素放大系統和特異性單抗的同時，引入已商品化的高純度標準品尤瑞克林。由于尤瑞克林已經應用缺血性腦卒中的補充治療，直接利用補充用藥作為標準品，更能直觀地判斷患者是否需要尤瑞克林的補充治療。
[0023]本專利技術對檢測方法進行優化，將原來的4.5小時的檢測時間縮短到1.5小時，從而大量節省了人力成本，并提升了產品質量，有利于臨床的廣泛應用。本項目首先通過優化了抗原的吸附條件，相對于傳統試劑盒來說減少了包被抗體包被ELISA反應板和封閉液封閉的步驟，從而將操作時間從以前的4.5小時縮短到了1.5小時。此外，本試劑盒的ELISA反應板在室溫保存即可，為該試劑盒的保持提供了便利。
附圖說明
[0024]圖1是蛋白質印跡(Western blot)檢測的內參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的表達；
[0025]圖2為蛋白質印跡(Western blot)檢測的人組織激肽釋放酶(TK)的表達；
[0026]圖3為本專利技術試劑盒的標準曲線圖。
具體實施方式
[0027]以下結合附圖、實施例和實驗例對本專利技術作進一步的詳細描述。當然，本專利技術的保護范圍并不限于下述實施例。本領域專業技術人員能夠理解，在不背離本專利技術精神的前提下，可以對本專利技術進行各種變化和修飾。本專利技術對實驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現本專利技術目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但本專利技術仍然在此作盡可能詳細的描述。以下實施例是進一步說明本專利技術，而不是限制本專利技術。任何依據本專利技術構思所作出的僅僅為形式上的而非實質性的等效變換都應視為本專利技術技術方案的范疇。
[0028]下述實施例中所述試驗方法或測試方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均從常規商業途徑獲得，或以常規方法制備。
[0029]實施例1
[0030]1、試劑及實驗儀器的準備
[0031]1.1試劑
[0032]1)洗滌液(pH7.4，0.15M)，0.2克KH2PO4，2.9克Na2HPO4·
12H2O，8.0克NaCl，0.2克KCl，0.5ml、0.1％Tween
?
20，加蒸餾水至1000ml；
[0033]2)樣品稀釋液(pH 9.6，0.05M)，1.59克Na2CO3，2.93克NaHCO3，1克牛血清白蛋白(BSA)，加蒸餾水至1000ml；
[0034]3)標準品：天普公司提供的尤瑞克林；
[0035]4)生物素化單克隆抗體：生物素標記的抗人組織激肽釋放酶單克隆抗體，為已知抗體；
[0036]5)抗體稀釋液(pH7.4，0.15M)0.2克KH2PO4，2.9克Na2HPO4·
12H2O，8.0克NaCl，0.2克KCl，加蒸餾水至1000ml；
[0037]6)酶標親和素：辣根過氧化物酶標記鏈本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種卒中檢測試劑盒，包括酶標反應板、檢測抗體、標準品、酶標親和素、檢測抗體稀釋液、樣品稀釋液、洗滌液、終止液、顯色液，其特征在于：所述檢測抗體為生物素標記的抗人組織激肽釋放酶單克隆抗體，所述標準品為尤瑞克林，所述酶標親和素為辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素。2.根據權利要求1所述的卒中檢測試劑盒，其特征在于：檢測靈敏度為5
?
500nM。3.根據權利要求1所述的卒中檢測試劑盒，其特征在于：所述洗滌液的pH值為7.4，濃度為0.15M，所述洗滌液由KH2PO4、Na2HPO4·
12H2O、NaCl、KCl、Tween
?
20和蒸餾水配制而成。4.根據權利要求1所述的卒中檢測試劑盒，其特征在于：所述樣品稀釋液的pH值為9.6，濃度為0.05M，所述樣品稀釋液由Na2CO3、NaHCO3、牛血清白蛋白和蒸餾水配制而成。5.根據權利要求1所述的卒中檢測試劑盒，其特征在于：所述檢測抗體稀釋液的pH值為7.4，濃度為0.15M，所述檢測抗體稀釋液由KH2PO4、Na2HPO4·
12H2O、N...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張琴，冉曉，汪道文，
申請(專利權)人：華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，
類型：發明
國別省市：