促使iPSC分化為中樞神經元細胞的方法及培養基和系統技術方案

本發明專利技術公開了一種促使誘導多能干細胞分化為中樞神經元細胞的方法及培養基和系統，S1：誘導多能干細胞的培養，所用的細胞培養器皿均經過玻連蛋白處理；S2：誘導多能干細胞分化為中樞神經干細胞，使用重組層粘連蛋白處理的細胞培養器皿，同時使用低動物源性中樞神經誘導培養基1或無動物源性中樞神經誘導培養基1；S3：中樞神經干細胞進一步分化為中樞神經元細胞，使用重組層粘連蛋白處理的細胞培養器皿，使用低動物源性中樞神經誘導培養基2或無動物源性中樞神經誘導培養基2。對比現有方法，本專利工藝顯著優化，2種培養基即可制備高純度的中樞神經元細胞，培養基化學成分明確，在培養基的質量控制和終產品質量控制上有明顯優勢，工藝整體可做到無動物源性，避免了動物源性致病因子污染風險，適用于大的表面面積的細胞培養器皿，加大了每個批次的中樞神經元細胞產量，有利工業化生產。有利工業化生產。有利工業化生產。

【技術實現步驟摘要】
促使iPSC分化為中樞神經元細胞的方法及培養基和系統


[0001]本專利技術涉及細胞生物學
，特別涉及一種促使誘導多能干細胞分化為中樞神經元細胞的方法及培養基和系統。

技術介紹

[0002]中樞神經系統的神經元細胞在疾病治療、藥物研發、科學研究等領域有巨大應用潛力。其中，疾病治療和藥物研發都需要數量較大、純度較高的中樞神經元細胞。中樞神經元細胞的現有獲得方法可分兩類，分別是組織提取法和干細胞分化法。其中，組織提取法通過從胚胎組織提取中樞神經元細胞，但因為可供使用的胚胎組織來源有限且每批次的組織因發育程度不同而質量參差不齊，并有著較大的道德爭議，其應用難以普及。干細胞分化法主要通過體外分化手段，將胚胎干細胞(Embryonic Stem Cell，ESC)或誘導多能干細胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)分化為中樞神經元細胞。然而，現有體外分化方法大多工藝復雜、耗時較長，所得到的中樞神經元細胞批次間質量差異較大，而分化過程所使用的試劑和物料種類繁多，其中更包含了牛血清白蛋白、鼠源細胞分泌物(基質膠，Matrigel)等大量的動物源性物料。故以現有干細胞分化法制備得到的中樞神經元細胞，和工業規模生產和實際臨床應用仍有較大的距離。另一方面，ESC本身的獲得需要消耗胚胎組織，有一定的道德爭議。此外，現有技術多用于科學研究，未嘗試摸索中樞神經元細胞大量生產的方法，未能滿足工業生產和治療應用的需求。
[0003]綜上，目前中樞神經元細胞的獲得途徑有限，制備工藝步驟較為復雜，使用物料種類繁多，制備耗時較常，導致了制備成本高、產量低，局限了其應用，亟需一種制備過程優化、制備時間短、成本低、污染風險小、產量和純度高、利于工業化生產的分化方法和培養基。

技術實現思路

[0004]針對現有技術中的缺陷，本專利技術提出了一種誘導多能干細胞分化為中樞神經元細胞的方法及培養基和系統，S1：誘導多能干細胞的培養，所用的細胞培養器皿均經過玻連蛋白處理；S2：誘導多能干細胞分化為中樞神經干細胞，使用重組層粘連蛋白處理的細胞培養器皿，同時使用低動物源性中樞神經誘導培養基1或無動物源性中樞神經誘導培養基1；S3：中樞神經干細胞進一步分化為中樞神經元細胞，使用重組層粘連蛋白處理的細胞培養器皿，使用低動物源性中樞神經誘導培養基2或無動物源性中樞神經誘導培養基2。
[0005]本專利技術提供一種促使誘導多能干細胞分化為中樞神經元細胞的方法，包括以下步驟：
[0006]S1：誘導多能干細胞的培養；
[0007]包括原代培養和傳代培養，所述原代培養和所述傳代培養中所用的細胞培養器皿均經過玻連蛋白處理；
[0008]S2：誘導多能干細胞分化為中樞神經干細胞；
[0009]開始分化前，將誘導多能干細胞接種在經過重組層粘連蛋白處理的細胞培養器皿中，使用低動物源性中樞神經誘導培養基1或無動物源性中樞神經誘導培養基1進行培養，更換培養基，培養8～10天，以胰酶替代物對誘導多能干細胞分化后得到的中樞神經干細胞進行處理，收集中樞神經干細胞；
[0010]S3：中樞神經干細胞進一步分化為中樞神經元細胞；
[0011]將中樞神經干細胞接種在經過重組層粘連蛋白處理的細胞培養器皿中，使用低動物源性中樞神經誘導培養基2或無動物源性中樞神經誘導培養基2進行培養，每隔24～36小時更換培養基，在培養1～4天后對中樞神經元細胞進行分析，檢測其純度和產量。
[0012]進一步的，所述步驟S1中所述原代培養和/或所述傳代培養中誘導多能干細胞的接種密度為1.0～2.5
×
104個/cm2，優選為1.5
×
104個/cm2。在1.5
×
104個/cm2的接種密度下誘導多能干細胞的相對產量最高。
[0013]進一步的，所述步驟S2中所述誘導多能干細胞的接種密度為1.5～3.5
×
104個/cm2，優選為2.5
×
104個/cm2。在2.5
×
104個/cm2的接種密度下中樞神經干細胞的產量最高。
[0014]進一步的，所述步驟S3中所述中樞神經干細胞的接種密度為1.0～3.0
×
104個/cm2，優選為3.0
×
104個/cm2。在3.0
×
104個/cm2的接種密度下中樞神經元細胞的產量最高。
[0015]進一步的，所述步驟S2中所述低動物源性中樞神經誘導培養基1包括以下成分：DMEM/F12培養基、非必需氨基酸、B27、胰島素、全鐵轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺、LDN193189、SB431542、XAV
?
939。其中，LDN193189、SB431542和XAV
?
939為潛在候選藥物的代號。
[0016]進一步的，所述步驟S2中所述無動物源性中樞神經誘導培養基1包括以下成分：DMEM/F12培養基、非必需氨基酸、胰島素、全鐵轉鐵蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黃體酮、視網醇、維生素A、dl
?
α
?
生育酚乙酸酯、維生素E、亞油酸、α
?
亞麻酸、硫辛酸、LDN193189、SB431542、XAV
?
939。
[0017]進一步的，所述步驟S3中所述低動物源性中樞神經誘導培養基2包括以下成分：神經元培養基、GlutaMAX、非必需氨基酸、B27、胰島素、全鐵轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺、腦源性神經營養因子、神經生長因子、PD0325901、SU5402。GlutaMAX是生產商的一個產品名稱，為谷氨酰胺的替代物，功能上等同于谷氨酰胺，因為高濃度的谷氨酰胺長期培養可產生細胞毒性。
[0018]進一步的，所述步驟S3中所述無動物源性中樞神經誘導培養基2包括以下成分：神經元培養基、GlutaMAX、非必需氨基酸、胰島素、全鐵轉鐵蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黃體酮、視網醇、維生素A、dl
?
α
?
生育酚乙酸酯、維生素E、亞油酸、α
?
亞麻酸、硫辛酸、腦源性神經營養因子、神經生長因子、PD0325901、SU5402。其中PD0325901和SU5402為潛在候選藥物的代號。
[0019]本專利技術還提供一種促使誘導多能干細胞分化為中樞神經元細胞的低動物源性中樞神經誘導培養基，包括以下成分：神經元培養基、GlutaMAX、非必需氨基酸、B27、胰島素、全鐵轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺、腦源性神經營養因子、神經生長因子、PD0325901、SU5402。其中，唯一有動物源性的成分是B27，因此所述中樞神經誘導培養基為低動物源性。
[0020]進一步的，所述GlutaMAX的含量為0.1～5％，所述含量為體積比；所述非必需氨基酸的含量為0.1～5％，所述含量為體積比；所述B27的含量為0.5～1％，所述含量為體積比；所述胰島本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種促使誘導多能干細胞分化為中樞神經元細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：S1：誘導多能干細胞的培養；包括原代培養和傳代培養，所述原代培養和所述傳代培養中所用的細胞培養器皿均經過玻連蛋白處理；S2：誘導多能干細胞分化為中樞神經干細胞；開始分化前，將誘導多能干細胞接種在經過重組層粘連蛋白處理的細胞培養器皿中，使用低動物源性中樞神經誘導培養基1或無動物源性中樞神經誘導培養基1進行培養，更換培養基，培養8～10天，以胰酶替代物對誘導多能干細胞分化后得到的中樞神經干細胞進行處理，收集中樞神經干細胞；S3：中樞神經干細胞進一步分化為中樞神經元細胞；將中樞神經干細胞接種在經過重組層粘連蛋白處理的細胞培養器皿中，使用低動物源性中樞神經誘導培養基2或無動物源性中樞神經誘導培養基2進行培養，每隔24～36小時更換培養基，在培養1～4天后對中樞神經元細胞進行分析，檢測其純度和產量。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S1中所述原代培養和/或所述傳代培養中誘導多能干細胞的接種密度為1.0～2.5
×
104個/cm2，優選為1.5
×
104個/cm2。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S2中所述誘導多能干細胞的接種密度為1.5～3.5
×
104個/cm2，優選為2.5
×
104個/cm2。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中所述中樞神經干細胞的接種密度為1.0～3.0
×
104個/cm2，優選為3.0
×
104個/cm2。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S2中所述低動物源性中樞神經誘導培養基1包括以下成分：DMEM/F12培養基、非必需氨基酸、B27、胰島素、全鐵轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺、LDN193189、SB431542、XAV
?
939。6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S2中所述無動物源性中樞神經誘導培養基1包括以下成分：DMEM/F12培養基、非必需氨基酸、胰島素、全鐵轉鐵蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黃體酮、視網醇、維生素A、dl
?
α
?
生育酚乙酸酯、維生素E、亞油酸、α
?
亞麻酸、硫辛酸、LDN193189、SB431542、XAV
?
939。7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中所述低動物源性中樞神經誘導培養基2包括以下成分：神經元培養基、GlutaMAX、非必需氨基酸、B27、胰島素、全鐵轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺、腦源性神經營養因子、神經生長因子、PD0325901、SU5402。8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S3中所述無動物源性中樞神經誘導培養基2包括以下成分：神經元培養基、GlutaMAX、非必需氨基酸、胰島素、全鐵轉鐵蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黃體酮、視網醇、維生素A、dl
?
α
?
生育酚乙酸酯、維生素E、亞油酸、α
?
亞麻酸、硫辛酸、腦源性神經營養因子、神經生長因子、PD0325901、SU5402。9.一種促使誘導多能干細胞分化為中樞神經元細胞的低動物源性中樞神經誘導培養基，其特征在于，包括以下成分：神經元培養基、GlutaMAX、非必需氨基酸、B27、胰島素、全鐵轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺、腦源性神經營養因子、神經生長因子、PD0325901、SU5402。10.根據權利要求9所述的培養基，其特征在于，所述GlutaMAX的含量為0.1～5％，所述
含量為體積比；所述非必需氨基酸的含量為0.1～5％，所述含量為體積比；所述B27的含量為0.5～1％，所述含量為體積比；所述胰島素的濃度為0.05～5μg/mL；所述全鐵轉鐵蛋白的濃度為1～50μg/mL；所述黃體酮的濃度為0.5～5ng/mL；所述腐胺的濃度為2～100μg/mL；所述腦源性神經營養因子的濃度為0.5～50ng/mL；所述神經生長因子的濃度為0.5～50ng/mL；所述PD0325901的濃度為1～20μg/mL；所述SU5402的濃度為1～20μg/mL。11.一種促使誘導多能干細胞分化為中樞神經元細胞的低動物源性中樞神經誘導培養基，其特征在于，包括以下成分：神經元培養基、GlutaMAX、非必需氨基酸、B27、胰島素、全鐵轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺、腦源性神經營養因子、神經生長因子、PD0325901、SU5402、DAPT。12.根據權利要求11所述的培養基，其特征在于，所述GlutaMAX的含量為0.1～5％，所述含量為體積比；所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：徐軼冰，施明耀，
申請(專利權)人：香港再生醫學有限公司，
類型：發明
國別省市：