具有提高的治療USH1B的安全性的雙AAV-MYO7A載體制造技術

公開了用于治療哺乳動物眼部疾病，并且特別是與厄舍綜合征IB(USH1B)相關的視網膜并發癥的組合物和方法。還公開了用于治療哺乳動物內耳疾病，并且特別是與厄舍綜合征IB(USH1B)相關的耳毛細胞并發癥的組合物和方法。本公開內容提供了改進的基于AAV的雙載體系統，其促進全長蛋白質的表達，所述全長蛋白質的編碼序列超過單個AAV載體的多核苷酸包裝容量。本文中描述了經修飾雜交體雙載體系統，其通過改變分裂點(例如，從外顯子23與24之間改變至外顯子21與22之間)將MY07A尾部結構域的編碼序列從前半載體轉移到后半載體，從而消除截短MY07A蛋白的產生。本文進一步描述了改進的、密碼子修飾的雜交體和重疊載體系統，其中去除了非編碼序列中的推定的終止密碼子和殘留序列。非編碼序列中的推定的終止密碼子和殘留序列。非編碼序列中的推定的終止密碼子和殘留序列。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】具有提高的治療USH1B的安全性的雙AAV
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MYO7A載體
[0001]相關申請
[0002]本申請要求于2020年4月1日提交的美國臨時申請No.63/003,774的申請日的權益，其全部內容通過引用并入。
[0003]非聯邦支持
[0004]本專利技術全部或部分由在來自抗擊失明基金會的贈款獎勵編號TA
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GT
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0419
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9774
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UFL
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GH下和在來自Atsena Therapeutics，Inc的協議編號AGR00018211下的經費完成。

技術介紹

[0005]重組AAV已成為治療視網膜疾病的可用的基因遞送載劑。然而，AAV的一個限制是其相對小的DNA包裝容量——大約4.7千堿基(KB)。因此，標準的AAV載體系統不適用于處理其中大基因被突變或在其他情況下功能失調的疾病，例如厄舍綜合征(Usher syndrome)。需要一種解決方案以便將大基因包裝到AAV載體系統中并將基因治療治療安全地遞送至患者。
[0006]專利技術概述
[0007]本公開內容一般性地涉及分子生物學和病毒學領域，并且特別地涉及基因遞送載劑的開發。公開了改進的rAAV雙載體和多核苷酸載體系統，以及組合物，其可用于將多種核酸區段(包括編碼治療性蛋白質、多肽、肽、反義寡核苷酸或核酶構建體的那些)遞送至所選宿主細胞以用于多種基因治療方案。還公開了包含任何的這些rAAV雙載體和多核苷酸載體系統的重組病毒顆粒、分離的宿主細胞和藥物組合物。還提供了用于制備和在多種基于病毒的基因治療(并且特別是用于治療和/或改善肌球蛋白VII缺陷的癥狀，在不受限制的情況下，包括治療人厄舍綜合征IB型)中使用本文中公開的改進的rAAV雙載體系統的方法。本文中還提供了治療或改善疾病或病狀的方法，其涉及施用編碼MYO7A蛋白并導致與先前可用的載體系統相比細胞毒性降低的rAAV雙載體系統。在一些方面中，提供了施用載體系統的方法，通過該方法使截短的MYO7A蛋白的量和/或相關的細胞毒性最小化。在一些實施方案中，治療性多肽不是肌球蛋白多肽。
[0008]在多個方面中，本文中提供的治療方法和藥物組合物旨在用于向對象(例如人或動物對象)的一只或兩只眼施用。在另外的多個方面中，本文中提供的治療方法和藥物組合物旨在用于向對象(例如人或動物對象)的一只或兩只耳施用。
[0009]本公開內容提供了用于疾病(例如厄舍綜合征)的基因治療的材料和方法。厄舍綜合征(包括I型(例如，USH1B)、II型和III型)是一種導致感覺病損的病癥，特別是在視覺、聽覺和前庭系統中。伴隨厄舍綜合征的感覺損失甚至可在出生時出現，并且隨著年齡的增長逐漸惡化。
[0010]厄舍綜合征USH1B最常見的形式是由肌球蛋白VIIa基因突變引起的嚴重的常染色體隱性、聾盲(deaf
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blindness)的病癥。患者由于人肌球蛋白VII蛋白(MYO7A)的表達不足和/或導致蛋白質功能失調(protein malfunction)的基因突變而天生耳聾。失明是從在生命的第一個十年中開始的進行性視網膜變性引起的。MYO7A蛋白在光感受器
(photoreceptor)和視網膜色素上皮(RPE)中表達，并涉及通過光感受器纖毛和RPE黑素小體的運動來參與視蛋白轉運。研究表明，光感受器(PR)可以是疾病的初始部位，并且其在人中光感受器外部區段周圍的黏附帶結構中的缺陷可導致在USH1B患者中所見的視網膜變性(Sahly，et al.，2012)。然而，MYO7A蛋白的編碼區的長度為6534或6648個核苷酸(取決于同種型)，使得傳統的AAV載體系統不適合用于USH1B的基因治療。
[0011]雖然目前沒有適合用于這種病癥的治療，但是基因治療為恢復/維持視覺、聽覺和前庭系統中的功能提供了希望。此前，Allocca et al.(2008)發表的結果表明AAV5血清型載體能夠包裝尺寸高至8.9KB的基因組，并且這些載體當在體內遞送時表達全長蛋白質。在Allocca et al.(2008)中，作者從含有驅動hMYO7A的CMV啟動子的AAV5載體中表達了全長MYO7A蛋白。隨后的研究證實了這些“超大”AAV5載體確實驅動了全長蛋白表達，然而發現每個載體衣殼的遺傳含量僅限于～5KB的DNA，而不是Allocca et al.(2008)最初報道的8.7KB(Lai et al.，2010；Dong et al.，2010；Wu et al.，2010)。這些載體衣殼被表明包含截短的載體基因組的“異質混合物”(例如，基因的5
’
端、基因的3
’
端、或具有內部序列缺失的二者的混合物)。另外，當與標準尺寸(＜5KB)的匹配報道載體相比，這些超大/異質載體表現出差的包裝效率(例如，導致低載體滴度)和低的轉導效率(Wu et al.，2010)。
[0012]使用在Lai et al.(2010)、Dong et al.(2010)和Wu et al.(2010)中所述的“異質”系統，盡管觀察到差的包裝效率，但包含MYO7A轉基因的一部分的載體仍被包裝，并且在USH1B的shaker
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1小鼠模型中證明了概念驗證階段(proof
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of
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concept)的結果。用異質AAV
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hMYO7A載體獲得的治療結果與先前使用基于慢病毒的hMYO7A載體的基因替代結果相當(Hashimoto et al.，2007)。這種慢病毒MYO7A載體正在由Oxford BioMedica與Sanofi
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Aventis合作開發以用于USH1B的I/II期臨床試驗，其以的名稱進行銷售。慢病毒被認為是一種載體平臺，其不能良好地適用于感染有絲分裂后(例如，非分裂)的細胞。此外，雖然該載體適合用于轉導RPE，但是許多研究表明其在轉導成人光感受器方面無效。因為光感受器(PR)可以是疾病的初始部位(Sahly，et al.，2012)，因此對RPE細胞的專屬靶向可能不會帶來完整或有效的治療，盡管其在人臨床試驗中仍有待觀察。
[0013]由于在LCA2/RPE65的AAV基因治療試驗中具有優異的安全性譜和令人鼓舞的效力報告，在創建用于治療USH1B患者的基于AAV的系統是持續令人感興趣的。本專利技術人先前已表征用于治療USH1B患者的AAV雙載體平臺，其也在本文中進行了描述。通過本專利技術人設計的原始雙載體系統(例如，“第一代”雙載體系統)已成功表明，由該系統產生的mRNA相對于其通過前和后載體對的正確同源重組所預測的而言是100％準確的，使得它們可用作基因治療遞送載體系統。這些載體在美國專利公開No.2019/0153050和2014/0256802中描述，其各自通過引用整體并入本文。
[0014]本公開內容至少部分地基于以下觀察結果：一些先前的雙載體平臺導致截短的MYO7A蛋白的產生，本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.多核苷酸載體系統，其包含：i)第一AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的啟動子，啟動子之后是編碼肌球蛋白多肽的N端部分的部分編碼序列，以及ii)第二AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的編碼所述肌球蛋白多肽的C端部分的部分編碼序列，其中編碼所述第一AAV載體和所述第二AAV載體中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重疊的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：63、90或66具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列；并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：77或80具有至少約80％至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。2.多核苷酸載體系統，其包含：i)第一AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的啟動子，啟動子之后是編碼肌球蛋白多肽的N端部分的部分編碼序列，以及ii)第二AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的編碼所述肌球蛋白多肽的C端部分的部分編碼序列，其中編碼所述第一AAV載體和所述第二AAV載體中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重疊的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV載體多核苷酸包含選自SEQ ID NO：63、90和66的核苷酸序列；并且所述第二AAV載體多核苷酸包含選自SEQ ID NO：77和80的核苷酸序列。3.多核苷酸載體系統，其包含：i)第一AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的啟動子，啟動子之后是編碼肌球蛋白多肽的N端部分的部分編碼序列，以及ii)第二AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的編碼所述肌球蛋白多肽的C端部分的部分編碼序列，其中編碼所述第一AAV載體和所述第二AAV載體中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重疊的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV載體多核苷酸編碼與SEQ ID NO：62、91或65的氨基酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列；并且所述第二AAV載體多核苷酸編碼與SEQ ID NO：78或81的氨基酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。4.權利要求1至3中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含SEQ ID NO：63的核苷酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含SEQ ID NO：77的核苷酸序列。5.權利要求1至3中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含SEQ ID NO：63的核苷酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含SEQ ID NO：80的核
苷酸序列。6.權利要求1至3中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含SEQ ID NO：90的核苷酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含SEQ ID NO：77的核苷酸序列。7.權利要求1至3中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含SEQ ID NO：90的核苷酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含SEQ ID NO：80的核苷酸序列。8.權利要求1至3中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含SEQ ID NO：66的核苷酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含SEQ ID NO：77的核苷酸序列。9.權利要求1至3中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含SEQ ID NO：66的核苷酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含SEQ ID NO：80的核苷酸序列。10.權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：50的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：51的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。11.權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：50的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：38的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。12.權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：38的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。13.權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：50的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。14.權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：51的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。15.權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸
包含與SEQ ID NO：36的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。16.權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：36的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：38的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。17.權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：36的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：51的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。18.權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：37的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：38的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。19.權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：37的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。20.權利要求1至9中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：37的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：51的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。21.多核苷酸載體系統，其包含：i)第一AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的啟動子，啟動子之后是編碼治療性多肽的N端部分的部分編碼序列，以及ii)第二AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的編碼所述治療性多肽的C端部分的部分編碼序列，其中編碼所述第一AAV載體和所述第二AAV載體中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重疊的多核苷酸序列，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含與選自SEQ ID NO：39和52至59中任一個的序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序
列。22.權利要求1至21中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列為約1至50個核苷酸、約100至500個核苷酸、約100至200個核苷酸、約200至300個核苷酸、約300至400個核苷酸、約400至500個核苷酸、約500至600個核苷酸、約600至700個核苷酸、約700至800個核苷酸、約800至900個核苷酸、約900至1000個核苷酸、約1000至1100個核苷酸、約1100至1200個核苷酸、或約1200至1300個核苷酸。23.權利要求1至22中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含與選自SEQ ID NO：39和52至59中任一個的序列具有至少約85％、90％、95％或98％同一性的核苷酸序列。24.權利要求1至23中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含選自SEQ ID NO：39和52至59中任一個的核苷酸序列。25.權利要求1至24中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：39。26.權利要求1至24中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：52。27.權利要求1至24中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：53。28.權利要求1至24中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：54。29.權利要求1至24中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：55。30.權利要求1至24中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：56。31.權利要求1至24中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：57。32.權利要求1至24中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：58。33.權利要求1至24中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：59。34.權利要求1至33中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中在所述第一AAV載體多核苷酸的每一端的所述反向末端重復之間的長度為約4615個核苷酸(nt)或更少。35.權利要求1至34中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中在所述第二AAV載體多核苷酸的每一端的所述反向末端重復之間的長度為約4800nt或更少。36.權利要求1至35中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中在所述第二AAV載體多核苷酸的每一端的所述反向末端重復之間的長度為約4560nt。37.多核苷酸載體系統，其包含：i)第一AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的啟動子，啟動子之后是編碼治療性多肽的N端部分的部分編碼序列，以及
ii)第二AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的編碼所述治療性多肽的C端部分的部分編碼序列，其中編碼所述第一AAV載體和所述第二AAV載體中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重疊的多核苷酸序列，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO：79和82至89中任一個的序列。38.權利要求37所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列為約1至50個核苷酸、約100至500個核苷酸、約100至200個核苷酸、約200至300個核苷酸、約300至400個核苷酸、約400至500個核苷酸、約500至600個核苷酸、約600至700個核苷酸、約700至800個核苷酸、約800至900個核苷酸、約900至1000個核苷酸、約1000至1100個核苷酸、約1100至1200個核苷酸或約1200至1300個核苷酸。39.權利要求1至38中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO：79的序列。40.權利要求1至38中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO：82的序列。41.權利要求1至38中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO：83的序列。42.權利要求1至38中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO：84的序列。43.權利要求1至38中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO：85的序列。44.權利要求1至38中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO：86的序列。45.權利要求1至38中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO：87的序列。46.權利要求1至38中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO：88的序列。47.權利要求1至38中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述有重疊的多核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO：89的序列。48.權利要求21至47中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述治療性多肽不是肌球蛋白多肽。49.權利要求21至48中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述治療性多肽：(i)是肌球蛋白；(ii)是harmonin、鈣黏著蛋白23、原鈣黏著蛋白15或usherin；(iii)由長度為約5Kb至約10Kb、約6Kb至約9Kb或約7Kb至約8Kb的基因編碼；和/或(iv)由選自以下的基因編碼：ABCA4、CEP290、EYS、RP1、ALMS1、CDH23、PCDH15、USH1C、USH1G、USH2A(usherin)、DNFB31、DMD、CFTR、GDE、DYSF、F8和DFNB2。50.多核苷酸載體系統，其包含：i)第一AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的啟動子，啟動子之后是編碼肌球蛋白多肽的N端部分的部分編碼序列，
以及ii)第二AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的編碼所述肌球蛋白多肽的C端部分的部分編碼序列，其中編碼所述第一AAV載體和所述第二AAV載體中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重疊的多核苷酸序列，并且其中所述肌球蛋白多肽的C端部分包含所述肌球蛋白多肽的單α螺旋(SAH)結構域。51.多核苷酸載體系統，其包含：i)第一AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的啟動子，啟動子之后是編碼肌球蛋白多肽的N端部分的部分編碼序列，以及ii)第二AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的編碼所述肌球蛋白多肽的C端部分的部分編碼序列，其中編碼所述第一AAV載體和所述第二AAV載體中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重疊的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：36的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：38的核苷酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。52.權利要求50或權利要求51所述的多核苷酸載體系統，其中所述肌球蛋白多肽是人肌球蛋白VIIa多肽、人肌球蛋白VIIb多肽、肌球蛋白VIIa同種型2、或者另一種肌球蛋白同種型或其功能片段。53.權利要求52所述的多核苷酸載體系統，其中所述人肌球蛋白VIIa多肽包含與SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列或其功能片段。54.權利要求1至20中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述肌球蛋白多肽是人肌球蛋白VIIa多肽、肌球蛋白VIIa同種型2、或者另一種肌球蛋白同種型或其功能片段。55.權利要求54所述的多核苷酸載體系統，其中所述人肌球蛋白VIIa多肽包含與SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列或其功能片段。56.多核苷酸載體系統，其包含：i)第一AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的啟動子，啟動子之后是編碼肌球蛋白多肽的N端部分的部分編碼序列，隨后是剪接供體位點和第一內含子，以及ii)第二AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的第二內含子和針對所述第一內含子的剪接接受體位點，其中所述第一內含子和所述第二內含子的核苷酸序列包含有重疊的多核苷酸序列，并且其中所述第一內含子序列和/或所述第二內含子序列包含與SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：70具有至少約80％至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸
序列。57.權利要求56所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一內含子序列包含SEQ ID NO：69的核苷酸序列。58.權利要求56所述的多核苷酸載體系統，其中所述第一內含子序列包含SEQ ID NO：70的核苷酸序列。59.權利要求56至58中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第二內含子序列包含SEQ ID NO：69的核苷酸序列。60.權利要求56至58中任一項所述的多核苷酸載體系統，其中所述第二內含子序列包含SEQ ID NO：70的核苷酸序列。61.多核苷酸載體系統，其包含：i)第一AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的啟動子，啟動子之后是編碼治療性多肽的N端部分的部分編碼序列，隨后是剪接供體位點和第一內含子，以及ii)第二AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的第二內含子和針對所述第一內含子的剪接接受體位點，其中所述第一內含子和所述第二內含子的核苷酸序列包含有重疊的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV載體多核苷酸序列與所述第二AAV載體多核苷酸序列之間的分裂點在編碼所述治療性蛋白質的基因的兩個外顯子之間。62.權利要求61所述的多核苷酸載體系統，其中所述治療性多肽：(i)是肌球蛋白VIIa、肌球蛋白VIIa的同種型、肌球蛋白VIIa同種型2、肌球蛋白VIIb、和肌球蛋白VIIb的同種型、harmonin、鈣黏著蛋白23、原鈣黏著蛋白15或usherin；(ii)由長度為約5Kb至約10Kb、約6Kb至約9Kb或約7Kb至約8Kb的基因編碼；和/或者(iii)由選自以下的基因編碼：ABCA4、CEP290、EYS、RP1、ALMS1、CDH23、PCDH15、USH1C、USH1G、USH2A(usherin)、DNFB31、DMD、CFTR、GDE、DYSF、F8和DFNB2。63.權利要求61或權利要求62所述的多核苷酸載體系統，其中編碼所述治療性蛋白質的所述基因是人MYO7A(hMYO7A)，并且其中所述分裂點：(i)在所述hMYO7A基因的外顯子21與外顯子22之間；(ii)在所述hMYO7A基因的外顯子22與外顯子23之間；和/或(iii)不在所述hMYO7A基因的外顯子23與外顯子24之間。64.多核苷酸載體系統，其包含：i)第一AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的啟動子，啟動子之后是編碼肌球蛋白多肽的N端部分的部分編碼序列，隨后是剪接供體位點和第一內含子，以及ii)第二AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的第二內含子和針對所述第一內含子的剪接接受體位點，其中所述第一內含子和所述第二內含子的核苷酸序列包含有重疊的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：73具有至少約80％、至少85％、至少
90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列；并且所述第二AAV載體多核苷酸包含與SEQ ID NO：75具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。65.多核苷酸載體系統，其包含：i)第一AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的啟動子，啟動子之后是編碼肌球蛋白多肽的N端部分的部分編碼序列，隨后是剪接供體位點和第一內含子，以及ii)第二AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的第二內含子和針對所述第一內含子的剪接接受體位點，其中所述第一內含子和所述第二內含子的核苷酸序列包含有重疊的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV載體多核苷酸包含選自SEQ ID NO：73的核苷酸序列；并且所述第二AAV載體多核苷酸包含選自SEQ ID NO：75的核苷酸序列。66.多核苷酸載體系統，其包含：i)第一AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的啟動子，啟動子之后是編碼肌球蛋白多肽的N端部分的部分編碼序列，隨后是剪接供體位點和第一內含子，以及ii)第二AAV載體多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重復，和在所述反向末端重復之間的第二內含子和針對所述第一內含子的剪接接受體位點，其中所述第一內含子和所述第二內含子的核苷酸序列包含有重疊的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV載體多核苷酸編碼與SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列；并且所述第二AAV載體多核苷酸編碼與SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少約80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％...

【專利技術屬性】
技術研發人員：香農，
申請(專利權)人：佛羅里達州大學研究基金會，
類型：發明
國別省市：