本發明專利技術提供了一種用于維生素B12檢測的解離劑，所述解離劑為單組分凍干試劑；所述單組分凍干試劑的原液包括：緩沖劑、結合劑、還原劑、保護劑與pH調節劑；其中，所述緩沖劑的摩爾濃度為20～100mM，所述結合劑的重量體積百分比為0.05％～0.2％，所述還原劑的重量體積百分比為0.05％～0.2％，所述保護劑的重量體積百分比為3％～8％，所述pH調節劑的重量體積百分比為1％～2％。本發明專利技術還提供了上述解離劑的制備方法與應用。本發明專利技術解離劑配方簡單，采用單組份試劑并使用凍干工藝，使用前使用超純水進行復溶放入化學發光試劑架R1中即可參與反應，一步操作解離樣本中的維生素B12。一步操作解離樣本中的維生素B12。一步操作解離樣本中的維生素B12。
【技術實現步驟摘要】
一種用于維生素B12檢測的解離劑及其制備與應用
[0001]本專利技術涉及醫學免疫體外診斷領域，尤其涉及一種用于維生素B12檢測的解離劑及其制備與應用。
技術介紹
[0002]維生素B12，又名鈷胺素(Cobal
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amin)，是一種預防和治療惡性貧血的維生素。維生素B12為紅色結晶粉末，無嗅無味，微溶于水和乙醇，在pH值4.5～5.0弱酸條件下最穩定，強酸(pH<2)或堿性溶液中分解，遇熱可有一定程度破壞。食物中的維生素B12與蛋白質結合，進入人體消化道內，在胃酸、胃蛋白酶及胰蛋白酶的作用下，維生素B12被釋放，并與胃粘膜細胞分泌的一種糖蛋白內因子(IF)結合。維生素B12
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IF復合物在回腸被吸收。維生素B12參與制造骨髓紅細胞，防止惡性貧血，防止大腦神經受到破壞。
[0003]在人血清或血漿中，維生素B12與內因子結合，以復合物的形式存在。由于維生素B12與內因子緊密結合，很少以游離形式存在，但游離形態是其可檢測的形態。因此，在檢測血液標本中，需要對樣本進行前處理，使維生素B12能夠從內因子解離出來。人體內的維生素B12有多個異構體形式，不同異構體的維生素B12從內因子上釋放，其具有不同的穩定性。故檢測時，若不能穩定的解離出維生素B12，可能會出現不同的檢測結果，導致偏差。
[0004]目前，市面上也存在一些解離劑，但卻普遍存在成分較復雜、穩定性差、反應時間長、操作繁瑣等問題。以羅氏為例，解離劑采用雙組份，分別為PT1、PT2試劑，且含有DTT，不穩定，容易水解；以江蘇拜明生物解離劑為例，解離劑采用三組分，分別含有穩定劑、變性劑、中和劑，需要先將樣本、穩定劑、變性劑第一次反應再加入中和劑進行反應，操作繁瑣。
[0005]因此，亟需一種高效、簡單、快速的用于人血液樣本中維生素B12含量檢測的解離劑，并應用于試劑盒中，以解決現有產品成分復雜、穩定性差、反應時間長、操作復雜等問題。
技術實現思路
[0006]本專利技術所要解決的技術問題在于提供一種用于維生素B12檢測的解離劑及其制備與應用，該解離劑可高效、簡單、快速的用于人血液樣本中維生素B12含量檢測，解決現有產品成分復雜、穩定性差、反應時間長、操作復雜的問題。
[0007]本專利技術采用以下技術方案解決上述技術問題：
[0008]一種用于維生素B12檢測的解離劑，采用單組分凍干試劑；所述單組分凍干試劑包括：緩沖劑20～100mM，結合劑0.05％～0.2％(重量體積百分含量)，還原劑0.05％～0.2％(重量體積百分含量)，保護劑3％～8％(重量體積百分含量)，pH調節劑1％～2％(重量體積百分含量)；其中，所述緩沖劑、結合劑、還原劑、保護劑與pH調節劑經混合后，采用冷凍干燥工藝，制備成相應凍干制品，保存備用。
[0009]其中，所述緩沖劑的摩爾濃度為20～100mM，例如可以是20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM等。
[0010]所述結合劑的重量體積百分含量為0.05％～0.2％，例如可以是0.05％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％或0.2％等。
[0011]所述還原劑的重量體積百分含量為0.05％～0.2％，例如可以是0.05％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％或0.2％等。
[0012]所述保護劑的重量體積百分含量為3％～8％，例如可以是3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％或8％等。
[0013]所述pH調節劑的重量體積百分含量為1％～2％，例如可以是1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2％等。
[0014]作為本專利技術的優選方式之一，所述緩沖劑為TRIS。本專利技術中所述緩沖液優選為TRIS緩沖液，相比于其他GOOD
’
s緩沖液，采用TRIS緩沖液后所得解離劑經凍干后穩定性較好，檢測結果更加準確。
[0015]作為本專利技術的優選方式之一，所述結合劑為含有氰根離子的鹽；優選地，所述結合劑為氰化鉀。
[0016]本專利技術中，所述維生素B12從結合蛋白上被充分釋放出來后，與氰化鉀中的氰根離子結合形成穩定的氰鈷胺素，以供測定。
[0017]作為本專利技術的優選方式之一，所述還原劑為三(2
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羧乙基)膦(TCEP)。本專利技術中，TCEP能夠還原結合蛋白的二硫鍵，破壞其二級結構，在堿性溶液中的穩定性也很好，優于其他類別的硫醇類還原劑如DTT，TCEP不僅是一種高效的二硫鍵還原劑，而且在某些巰基的交聯反應中不需要除掉。
[0018]同時，經實驗發現，當還原劑TCEP與氰化鉀同時使用且兩者使用量均小于等于0.2％時，其檢測穩定性較好；其他組合如DTT與六氰合鐵酸鉀聯用、TCEP與六氰合鐵酸鉀聯用或DTT與氰化鉀均無法達到較穩定的效果；即使加大結合劑和還原劑的使用量也同樣如此。
[0019]作為本專利技術的優選方式之一，所述保護劑為海藻糖。本專利技術中海藻糖則提供一個相對穩定的環境，亦可作為凍干的塑形劑以增加穩定性、重復性。
[0020]作為本專利技術的優選方式之一，所述pH調節劑為氫氧化鈉，用于調節所述解離劑混合體系pH至在12.0～14.0，例如可以是12、12.2、12.5、12.8、13、13.5、13.8、14.0。本專利技術中所述混合體系的pH值有助于待測樣本中的維生素B12從結合蛋白上釋放出來，使檢測結果更加穩定。
[0021]優選地，所述單組分凍干試劑的原液中，所述結合劑的重量體積百分比為0.1％～0.15％，所述還原劑的重量體積百分比為0.1％～0.15％，所述保護劑的重量體積百分比為4％～6％。
[0022]本專利技術還提供一種所述用于維生素B12檢測的解離劑的制備方法，所述緩沖劑、結合劑、還原劑、保護劑與pH調節劑經混合后，采用如下具體方法制備成相應凍干制品：
[0023](1)先將稱取緩沖劑、pH調節劑、還原劑、結合劑、保護劑，加入至容器中攪拌均勻，加入純化水，補充至所需總體積，再調節溶液酸堿度至12.0～14.0；再將所得混合樣品均勻擺在托盤內，放到干燥室內，放好溫度探頭，關閉干燥室門和進氣口閥門；
[0024](2)開啟冷凍干燥設備進行預凍，當樣品溫度和隔板溫度達到設定溫度后，開啟真空泵；真空度顯示低于≤50Pa；
[0025](3)隨后進行真空冷凍干燥，當樣品溫度和隔板溫度達到設定溫度后，觀察凍干曲線，當水分含量穩定后，關閉真空泵；
[0026](4)開啟液壓系統對樣品進行密封，打開進氣閥閥門待內外氣壓平衡后，打開干燥室門，取出樣品。
[0027]優選地，步驟(1)所述混合樣品使用本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種用于維生素B12檢測的解離劑，其特征在于，所述解離劑為單組分凍干試劑；所述單組分凍干試劑的原液包括：緩沖劑、結合劑、還原劑、保護劑與pH調節劑；其中，所述緩沖劑的摩爾濃度為20～100mM，所述結合劑的重量體積百分比為0.05％～0.2％，所述還原劑的重量體積百分比為0.05％～0.2％，所述保護劑的重量體積百分比為3％～8％，所述pH調節劑的重量體積百分比為1％～2％。2.根據權利要求1所述的用于維生素B12檢測的解離劑，其特征在于，所述緩沖劑為TRIS。3.根據權利要求1所述的用于維生素B12檢測的解離劑，其特征在于，所述結合劑為含有氰根離子的鹽。4.根據權利要求1所述的用于維生素B12檢測的解離劑，其特征在于，所述還原劑為三(2
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羧乙基)膦。5.根據權利要求1所述的用于維生素B12檢測的解離劑，其特征在于，所述保護劑為海藻糖；所述pH調節劑為氫氧化鈉，用于調節所述解離劑混合體系pH至12.0～14.0。6.根據權利要求1所述的用于維生素B12檢測的解離劑，其特征在于，所述單組分凍干試劑的原液中，所述結合劑的重量體積百分比為0.1％～0.15％，所述還原劑的重量體積百分比為0.1％～0.15％，所述保護劑的重量體積百分比為4％～6％。7.一種如權利要求1～6任一所述的用于維生素B12檢測的解離劑的制備方法，其特征在于，所述緩沖劑、結合劑、還原劑、保護劑與pH調節劑經混合后，采用如下具體方法制備成相應凍干制品：(1)先將稱取緩沖劑、pH調節劑、還原劑、結合劑、保護劑，加入至容器中攪拌均勻，加入純化水，補充至所需總體積，再調節溶液酸堿度至12.0～1...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陶然，朱雨，寧吉英，張金東，蔡曉輝，
申請(專利權)人：安徽伊普諾康生物技術股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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