具備較強抗凝血活性的醫蛭基因突變水蛭素及其制備方法技術

在分子動力學（MD）蛋白質結合力分析、分子生物學以及藥理學篩選基礎上，本專利制備了醫蛭（Hirudo medicinalis）基因突變水蛭素（HV1）HV1

【技術實現步驟摘要】
具備較強抗凝血活性的醫蛭基因突變水蛭素及其制備方法


[0001]本專利技術屬于蛋白質工程制藥領域，具體涉及一組一級結構改造的醫蛭基因重組水蛭素，及其制備和分離純化方法。

技術介紹

[0002]天然水蛭素是從吸血水蛭的唾液腺中提取的一種單鏈多肽，是目前已知的最有效的凝血酶抑制劑，其中HV1是由醫蛭(Hirudo medicinalis)分泌。 HV1由65個氨基酸殘基組成，相對分子質量為7.8kD，C末端富含酸性氨基酸，包括第63位可以發生硫酸化修飾的酪氨酸。在凝血途經中，水蛭素以凝血級聯反應中的核心酶
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凝血酶作為靶標，通過離子鍵和疏水作用力與凝血酶緊密且不可逆轉地結合，使其失去裂解可溶性纖維蛋白原的能力，從而阻止不溶性纖維蛋白的形成。多種動物模型和臨床藥理研究表明，水蛭素能有效防治血栓性疾病，尤其是凝血酶起關鍵作用的疾病。同時，水蛭素具有不需要任何內源性輔助因子 (如抗凝血酶(AT))，出血少，免疫原性低等優點。
[0003]目前，天然水蛭素只能以很低的產量分離出來，且藥用水蛭的數量有限，無法制備足夠的水蛭素用于治療目的。近年來，也有研究者利用微生物表達基因重組水蛭素，但是與天然水蛭素相比，微生物表達的水蛭素C末端缺乏酪氨酸O
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硫酸化修飾，缺少與“外部位點I”相互作用的帶有負電荷的基團，因此抗凝血活性低于野生型水蛭素。為了解決這一問題，我們利用基因工程技術將C 末端的多個氨基酸殘基突變為天冬氨基酸，以增加水蛭素C末端所帶的負電荷，獲得較高抗凝血活性的基因重組藥用水蛭水蛭素。

技術實現思路

[0004]1.專利技術的目的
[0005]利用大腸桿菌工程菌種表達并純化具有較強抗凝血活性的醫蛭基因重組水蛭素突變體，及其制備方法。
[0006]2.專利技術的技術方案
[0007]一、提高抗凝血活性的重組水蛭素HV1突變體的設計
[0008]利用GROMACS分子動力學(MD)分析系統的WHAM模塊，我們分析了野生型以及多種突變型HV1的C末端與凝血酶的結合力。分析結果表明，通過氨基酸殘基突變為天冬氨酸(Asp或D)增加C末端的負電荷(圖1)，可以提高水蛭素與凝血酶的親和力(圖2)。MD分析可以提供一定的理論依據，實際作用需要通過實驗來驗證。在MD分析基礎上，我們設計了多種用于提高水蛭素HV1抗凝血活性的突變體，并進行篩選，本專利設計所描述的是其中的的HV1的突變體HV1
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L64D和HV1
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L64D(圖3)。
[0010]二、基因重組水蛭素HV1及其突變體的表達質粒構建
[0011]模板的準備：從NCBI獲得HV1的CDS序列。根據原核表達系統中密碼子的偏好性，進行堿基序列優化(核苷酸或氨基酸序列表中第2條序列)，并合成。
[0012]序列的準備：設計PCR引物，利用上游引物引入His親和純化標簽，利用下游引物序
列引入氨基酸突變位點的堿基序列。
[0013]PCR擴增：將HV1的第62位谷氨酸(E)和第64位亮氨酸(L)同時突變為天冬氨酸(D)(核苷酸或氨基酸序列表中第3、4條序列)，將第62位谷氨酸(E)、第63位酪氨酸(Y)和第64位亮氨酸(L)同時突變為天冬氨酸 (D)(核苷酸或氨基酸序列表中第5、6條序列)，擴增得到兩端帶有限制性內切酶位點(NdeI和HindIII)的cDNA片段，分別為NdeI
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HindIII、 NdeI
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HindIII、以及NdeI
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HindIII。
[0014]限制性內切酶酶切：雙酶切DNA片段NdeI
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HindIII、 NdeI
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HindIII、和NdeI
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HindIII、以及載體pET21a(+)，產生粘性末端。
[0015]T4連接酶連接：用T4連接酶分別將切出粘性末端的 NdeI
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HindIII、NdeI
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HindIII與切開的表達載體pET21a(+)連接，構建帶有His親和純化標簽的HV1 pET21a(+)、HV1
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L64D pET21a(+)、 HV1
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L64D pET21a(+)原核表達重組質粒。
[0016]重組質粒的鑒定：將重組質粒轉化到大腸桿菌DH5α，陽性克隆子進行雙酶切鑒定和DNA測序。
[0017]三、基因重組水蛭素蛋白HV1、HV1
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L64D、HV1
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L64D的原核表達
[0018]將構建成功的重組質粒通過熱激法轉化到大腸桿菌表達菌株(BL21 衍生株E.coli str.B F
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)gal dcm lacY1 ahpC gor522 trxB(DE3))，加入異丙基
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硫代半乳糖苷(IPTG)誘導目的蛋白小量表達；篩選高表達菌株，進行大量表達。
[0019]利用超聲法破碎表達HV1、HV1
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L64D、HV1
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【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.醫蛭(Hirudo medicinalis)基因重組水蛭素(HV1)氨基酸突變蛋白HV1
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Y63D
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L64D，其特征在于，該重組蛋白以HV1的氨基酸序列為母本，將其第62位谷氨酸(E)、第63位酪氨酸(Y)和第64位亮氨酸(L)同時突變為天冬氨酸(D)。2.HV1突變蛋白HV1
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E62D
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L64D，其特征在于，該重組蛋白以HV1的氨基酸序列為母本，將其第62位谷氨酸(E)和第64位亮氨酸(L)同時突變為天冬氨酸(D)。3.基因重組野生型HV1的經過優化的核苷酸序列。4.權利要求1所述的HV1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王大勇，孫艷，王葆春，王大欣，裴業春，韋雙雙，閔義，請求不公布姓名，請求不公布姓名，請求不公布姓名，
申請(專利權)人：王大勇，
類型：發明
國別省市：