對細胞進行基因修飾以遞送治療性蛋白質的方法技術

本公開提供了通過插入人工外顯子(ArtEx)對細胞進行基因修飾以便在特定細胞類型中遞送治療性蛋白質的方法，并且更特別地提供了用于將轉基因表達到患者大腦的工程化細胞。于將轉基因表達到患者大腦的工程化細胞。于將轉基因表達到患者大腦的工程化細胞。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】對細胞進行基因修飾以遞送治療性蛋白質的方法


[0001]本專利技術整體上涉及基因治療領域，并且更具體地涉及遺傳性基因疾病的治療和預防。特別地，本公開提供了通過插入人工外顯子(ArtEx)對細胞進行基因修飾以便在特定細胞類型中遞送治療性蛋白質的方法，并且更特別地提供了用于將轉基因表達到患者大腦的工程化的細胞。

技術介紹

[0002]由于在通常編碼酶的基因中的缺陷，先天性代謝錯誤是一大類單基因病癥。這種遺傳缺陷導致各種組織中未降解底物的積累，導致可變的臨床表現，其通常會影響中樞神經系統。這些疾病的護理標準(如果可用)通常涉及靜脈內遞送治療性蛋白質。這可以改善病癥，因為治療性蛋白質被受影響的細胞所吸收，從而糾正了缺陷。這種在一個細胞中制造的基因產品(或以治療方式遞送)被受影響的細胞吸收以糾正缺陷的策略被稱為交叉糾正。然而，治療性地將蛋白質遞送到血漿中并不能解決在這些患者中看到的神經系統缺陷，因為該蛋白質不能穿過血腦屏障(或沒有足夠數量的蛋白質穿過血腦屏障)。因此，用于這些疾病的將治療性蛋白質遞送至血漿的任何治療性策略，諸如靜脈轉移治療性蛋白質或用基因療法將肝臟或任何其它器官轉換為治療性蛋白質生產設施，將無法消散該疾病的神經癥狀。
[0003]因此，特別需要用于向大腦遞送以治療遺傳性疾病的方法和治療性組合物。
[0004]僅為提供信息目的而提供該背景信息。不一定承認且不應該解決任何前述信息構成針對本專利技術的現有技術。

技術實現思路

[0005]應當理解的是，上述對實施方式的一般描述以及下列詳細描述均是示例性的，因此不限制實施方式的范圍。
[0006]在一個方面，本專利技術提供了基因修飾的造血干細胞(HSC)，其包括在合適的基因座處共表達的治療性基因產物，該合適的基因座在多種造血譜系中很活躍，諸如巨噬細胞，并且更特別地是填充大腦的組織駐留小膠質細胞。本文所描述的方法可以通過治療性基因產物在髓系統和來源于它的組織中的外源性表達來治療患者。本專利技術特別有利的是，通過從造血譜系衍生出來的填充大腦的小膠質細胞，將健康等位基因交叉表達到大腦中，以獲得有害等位基因的交叉糾正。
[0007]在另一方面，本專利技術依賴于使用可編程核酸酶(諸如轉錄激活器樣效應物核酸酶(TALEN)、鋅指核酸酶(ZFN)、簇狀規則間隔的短回文重復序列(CRISPR)
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Cas、大范圍核酸酶和megaTAL(融合至大范圍核酸酶的轉錄激活器樣(TAL))加上用于該基因座的修復模板的遞送對造血干細胞(HSC)或iPS細胞的離體修飾，修復模板提供有促進基因座的同源定向修復(HDR)的重組腺相關病毒(rAAV)。使用該策略，可以將修復模板DNA中編碼的任何基因修飾并入在靶基因座處，包括并入治療性基因產物，諸如互補DNA(cDNA)。在一些實施方式中，
治療性基因產物將受到靶基因座的調控控制并且促進造血細胞且特別是小膠質細胞中的表達。隨后通過過繼細胞轉移或自體HSC移植將經修飾的細胞返回到患者。該方法將全身性遞送治療性基因產物以治療身體，并且局部遞送在大腦中以治療疾病的全部癥狀。
[0008]在另一方面，本專利技術提供了一種將轉基因表達到患者大腦中的方法，包括：
[0009]i)獲得基因修飾的造血干細胞(HSC)，其中HSC分離自患者或者獲自來源于患者并且分化成HSC的誘導多能干(iPS)細胞，其中基因修飾的HSC被工程化為包括整合在小膠質細胞中表達的基因座處的轉基因；和
[0010]ii)將基因修飾的HSC移植到患者中，以使其分化為將轉基因表達到患者大腦中的小膠質細胞。
[0011]在另一方面，本專利技術提供了一種將轉基因表達到患者大腦中的方法，包括：
[0012]i)獲得基因修飾的造血干細胞(HSC)，其中HSC分離自相容供體或者獲自來源于相容供體并且分化成HSC的誘導多能干(iPS)細胞，其中基因修飾的HSC被工程化為包括整合在小膠質細胞中表達的基因座處的轉基因；
[0013]ii)將基因修飾的HSC移植到患者中，以使其分化為將轉基因表達到患者大腦中的小膠質細胞。
[0014]在另一方面，本專利技術提供了一種分離的HSC或iPS細胞，其具有整合在選自TMEM119、CD11B、B2m、CX3CR1或S100A9的基因座處的轉基因，所述轉基因受所述基因的內源性啟動子的轉錄控制。在一些實施方式中，HSC或iPS細胞用于用作藥物。在一些實施方式中，HSC或iPS細胞用于在治療在與轉基因同源的內源基因的表達方面有缺陷的患者中使用(交叉糾正)。在一些實施方式中，HSC或iPS細胞用于在溶酶體貯積病的治療中使用。
[0015]在一些實施方式中，在小膠質細胞中表達的基因座選自由以下組成的組：TMEM119、S100A9、CD11B、B2m、Cx3cr1、MERTK、CD164、Tlr4、Tlr7、Cd14、Fcgr1a、Fcgr3a、TBXAS1、DOK3、ABCA1、TMEM195、MR1、CSF3R、FGD4、TSPAN14、TGFBRI、CCR5、GPR34、SERPINE2、SLCO2B1、P2ry12、Olfml3、P2ry13、Hexb、Rhob、Jun、Rab3il1、Ccl2、Fcrls、Scoc、Siglech、Slc2a5、Lrrc3、Plxdc2、Usp2、Ctsf、Cttnbp2nl、Atp8a2、Lgmn、Mafb、Egr1、Bhlhe41、Hpgds、Ctsd、Hspa1a、Lag3、Csf1r、Adamts1、F11r、Golm1、Nuak1、Crybb1、Ltc4s、Sgce、Pla2g15、Ccl3l1、Abhd12、Ang、Ophn1、Sparc、Pros1、P2ry6、Lair1、Il1a、Epb41l2、Adora3、Rilpl1、Pmepa1、Ccl13、Pde3b、Scamp5、Ppp1r9a、Tjp1、Ak1、B4galt4、Gtf2h2、Trem2、Ckb、Acp2、Pon3、Agmo、Tnfrsf17、Fscn1、St3gal6、Adap2、Ccl4、Entpd1、Tmem86a、Kctd12、Dst、Ctsl2、Abcc3、Pdgfb、Pald1、Tubgcp5、Rapgef5、Stab1、Lacc1、Tmc7、Nrip1、Kcnd1、Tmem206、Hps4、Dagla、Extl3、Mlph、Arhgap22、Cxxc5、P4ha1、Cysltr1、Fgd2、Kcnk13、Gbgt1、C18orf1、Cadm1、Bco2、Adrb1、C3ar1、Large、Leprel1、Liph、Upk1b、P2rx7、Slc46a1、Ebf3、Ppp1r15a、Il10ra、Rasgrp3、Fos、Tppp、Slc24a3、Havcr2、Nav2、Apbb2、Clstn1、Blnk、Gnaq、Ptprm、Frmd4a、Cd86、Tnfrsf11a、Spint1、Ppm1l、Tgfbr2、Cmklr1、Tlr6、Gas6、Hist1h2ab、Atf3、Acvr1、A本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.一種用于在插入位點處將外源性編碼序列整合到內源性內含子基因組區域中的方法，包括下列步驟：
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提供包括內源性內含子基因組區域的細胞，
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向所述細胞中引入包括外源性編碼序列的多核苷酸模板，其中所述多核苷酸模板包括：a)第一同源多核苷酸序列，其與所述插入位點上游的內含子序列同源，b)第一強剪接位點序列，包括分支點和剪接受體；c)編碼2A自切割肽的第一序列；d)編碼目的蛋白質的外源序列；e)編碼2A自切割肽的第二序列；f)第一外顯子的編碼序列的拷貝；g)包括剪接供體的第二強剪接位點序列；和h)第二同源多核苷酸序列，其與所述插入位點下游的內含子序列同源；
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誘導所述外源性多核苷酸至所述內含子序列中的整合，優選地通過同源重組，以使所述外源性編碼序列在所述內源性基因座處與所述第一外顯子或它的拷貝一起轉錄。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述整合形成人工外顯子(Artex)并且被引入到造血干細胞(HSC)中，以獲得所述外源性編碼序列到至少一種造血細胞譜系中的表達。3.根據權利要求1至2中任一項所述的方法，其中所述外源性編碼序列編碼用于治療基因疾病的目的蛋白質。4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述外源性編碼序列用于在祖細胞中表達。5.根據權利要求4所述的方法，其中所述外源性編碼序列表達從FANCA、FANCC或FANCG中選擇的蛋白質。6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述外源性編碼序列使所述目的蛋白質在紅細胞中表達。7.根據權利要求6所述的方法，其中所述外源性編碼序列表達選自HBB、PKLR或RPS19中的蛋白質。8.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述外源性編碼序列用于在粒細胞中表達。9.根據權利要求9所述的方法，其中所述外源性編碼序列表達選自HAX1、CYBA、CYBB、NCF1、NCF2或NCF4中的蛋白質。10.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述外源性編碼序列用于在巨核細胞中表達。11.根據權利要求11所述的方法，其中所述外源性編碼序列表達選自因子8、因子9、因子11或WAS中的蛋白質。12.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述外源性編碼序列用于在單核細胞中表達。13.根據權利要求13所述的方法，其中所述外源性編碼序列表達選自IDUA、IDS、ARSB、GUSB、ABCD1、GALC、ARSA、PSAP、GBA、FUCA1、MAN2B1、AGA、ASAH1、HEXA、GAA、SMPD1、LIPA和
CDKL5中的蛋白質。14.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述外源性編碼序列用于在B細胞中表達。15.根據權利要求15所述的方法，其中所述外源性編碼序列表達選自ADA、IL2RG、WAS或BTK中的蛋白質。16.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述外源性編碼序列用于在T細胞中表達。17.根據權利要求5所述的方法，其中所述外源性編碼序列表達選自ADA、IL2RG、WAS、BTK或CCR5中的蛋白質。18.根據權利要求1至18中任一項所述的方法，其中所述外源性序列的所述表達還允許所述內源性基因座的表達，尤其是所述插入位點下游的內含子序列。19.根據權利要求1至19中任一項所述的方法，其中所述外源性編碼序列的表達產生允許交叉糾正內源性缺陷蛋白的目的蛋白質。20.根據權利要求1至20中任一項所述的方法，其中所述方法離體進行以生產工程化的治療性細胞。21.一種插入載體，例如AAV載體，其特征在于所述載體包括用于在內源性基因座處插入的外源性多核苷酸序列，所述外源性多核苷酸序列包括下列序列：a)第一同源多核苷酸序列，其與插入位點上游的所述內含子序列同源，b)第一強剪接位點序列，包括分支點和剪接受體；c)編碼2A自切割肽的第一序列；d)編碼目的蛋白質的外源序列；e)編碼2A自切割肽的第二序列；f)第一外顯子的編碼序列的拷貝；g)包括剪接供體的第二強剪接位點序列；和h)第二同源多核苷酸序列，其與所述插入位點下游的所述內含子序列同源。22.根據權利要求22所述的插入載體，其中所述第一同源序列和第二同源序列與選自以下的內源性基因座同源：tmem119、s100a9、cd11b、b2m、cx3cr1、mertk、cd164、tlr4、tlr7、cd14、fcgr1a、fcgr3a、tbxas1、dok3、abca1、tmem195、mr1、csf3r、fgd4、tspan14、tgfbri、ccr5、gpr34、serpine2、slco2b1、p2ry12、olfml3、p2ry13、hexb、rhob、jun、rab3il1、ccl2、fcrls、scoc、siglech、slc2a5、lrrc3、plxdc2、usp2、ctsf、cttnbp2nl、atp8a2、lgmn、mafb、egr1、bhlhe41、hpgds、ctsd、hspa1a、lag3、csf1r、adamts1、f11r、golm1、nuak1、crybb1、ltc4s、sgce、pla2g15、ccl3l1、abhd12、ang、ophn1、sparc、pros1、p2ry6、lair1、il1a、epb41l2、adora3、rilpl1、pmepa1、ccl13、pde3b、scamp5、ppp1r9a、tjp1、ak1、b4galt4、gtf2h2、trem2、ckb、acp2、pon3、agmo、tnfrsf17、fscn1、st3gal6、adap2、ccl4、entpd1、tmem86a、kctd12、dst、ctsl2、abcc3、pdgfb、pald1、tubgcp5、rapgef5、stab1、lacc1、tmc7、nrip1、kcnd1、tmem206、hps4、dagla、extl3、mlph、arhgap22、cxxc5、p4ha1、cysltr1、fgd2、kcnk13、gbgt1、c18orf1、cadm1、bco2、adrb1、c3ar1、large、leprel1、liph、upk1b、p2rx7、slc46a1、ebf3、ppp1r15a、il10ra、rasgrp3、fos、tppp、slc24a3、havcr2、nav2、apbb2、clstn1、blnk、gnaq、ptprm、frmd4a、cd86、tnfrsf11a、spint1、ppm1l、tgfbr2、cmklr1、tlr6、
gas6、hist1h2ab、atf3、acvr1、abi3、lrp12、ttc28、plxna4、adamts16、rgs1、icam1、snx24、ly96、dnajb4和ppfia4。23.根據權利要求22或23所述的插入，其中由所述外源性編碼序列編碼的所述治療性蛋白質與IDUA、IDS、ARSB、GUSB、ABCD1、GALC、ARSA、PSAP、GBA、FUCA1、MAN2B1、AGA、ASAH1、HEXA、GAA、SMPD1、LIPA和CDKL5(SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:35
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見表1)具有至少80％多肽序列同一性。24.一種工程化的細胞，其特征在于所述細胞根據權利要求1至21中任一項所述的一種方法可獲得。25.一種工程化的細胞，其特征在于外源性多核苷酸序列被插入到內源性基因座處的內含子中，所述多核苷酸序列包括：
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【專利技術屬性】
技術研發人員：亞歷山大，
申請(專利權)人：塞勒克提斯公司，
類型：發明
國別省市：