聚乙二醇化血管內(nèi)皮抑制素類似物及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素類似物及其應(yīng)用，所述血管內(nèi)皮抑制素類似物在遠(yuǎn)離nucleolin結(jié)合區(qū)域的賴氨酸與聚乙二醇偶聯(lián)或者在遠(yuǎn)離nucleolin結(jié)合區(qū)域的賴氨酸以及N端的氨基與聚乙二醇偶聯(lián)，由此使得其抑制腫瘤細(xì)胞遷移的生物學(xué)活性提高。本發(fā)明專利技術(shù)的聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素類似物與未修飾的血管內(nèi)皮抑制素相比具有更高的穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，而且其抑制新生血管生成活性顯著提高。著提高。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
聚乙二醇化血管內(nèi)皮抑制素類似物及其應(yīng)用
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01780069252.1、申請(qǐng)日為2017年11月10日，專利技術(shù)名稱為“聚乙二醇化血管內(nèi)皮抑制素類似物及其應(yīng)用”的中國(guó)專利技術(shù)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，在此通過(guò)引用將該中國(guó)專利技術(shù)專利申請(qǐng)的全文并入本文。


[0002]本專利技術(shù)涉及新的重組蛋白質(zhì)藥物。具體而言，本專利技術(shù)涉及聚乙二醇化血管內(nèi)皮抑制素類似物及其應(yīng)用。

技術(shù)介紹

[0003]新生血管形成是指新的毛細(xì)血管在原有的血管上的生成。腫瘤的生長(zhǎng)和遷移依賴于新生血管的生成，將腫瘤中的微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為癌癥治療的靶點(diǎn)為治療腫瘤提供了一種治療方式(Folkman J.N Engl J Med 1971；285:1182
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1186)。
[0004]血管內(nèi)皮抑制素(Endostatin)是膠原XVIII羧基端的一段分子量為20kDa的酶切產(chǎn)物。1997年美國(guó)哈佛大學(xué)Judah Folkman教授等人在血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)此蛋白，它具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和體內(nèi)血管生成的活性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組血管內(nèi)皮抑制素可以抑制老鼠體內(nèi)多種腫瘤的生長(zhǎng)、遷移，甚至能完全治愈腫瘤，而且不產(chǎn)生耐藥性。其發(fā)揮活性的機(jī)理在于它通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制了腫瘤組織附近的新生血管的生成，使得腫瘤組織得不到生長(zhǎng)所必需的大量營(yíng)養(yǎng)和氧氣，最后停止生長(zhǎng)或壞死(Folkman J.et al.Cell 1997；88:277
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285；Folkman J.et al.Nature 1997；390：404
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407)。2010年清華大學(xué)羅永章教授等人發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮抑制素還可以顯著抑制腫瘤相關(guān)的淋巴管生成(Yongzhang Luo.et al.Journal of Pathology 2010；222：249
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260；Yongzhang Luo.Front.Med.2011,5:336
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340.)。通過(guò)基因工程制備的重組人血管內(nèi)皮抑制素可以作為腫瘤治療藥物，其臨床試驗(yàn)表明它可以有效的抑制腫瘤生長(zhǎng)。在中國(guó)，以非小細(xì)胞肺癌為主要適應(yīng)癥的臨床試驗(yàn)表明它對(duì)于腫瘤的治療效果比較突出。
[0005]多年來(lái)腫瘤治療主要依靠小分子化合物治療(化療：chemotherapy)和放射治療(放療：radiotherapy)。這兩種方法雖然都非常有效，但是也存在一些毒副反應(yīng)。相比之下，蛋白類藥物毒副作用更小，而且不產(chǎn)生耐藥性，但是采用經(jīng)胃腸道給藥會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的首過(guò)效應(yīng)(first pass effect)。為了達(dá)到最高的體內(nèi)活性，提高生物利用度，減少藥物體內(nèi)降解，通常蛋白類藥物采用靜脈或皮下注射給藥方式。對(duì)于分子量小的蛋白來(lái)說(shuō)，通常靜脈給藥后藥物體內(nèi)半衰期很短，其中一個(gè)重要的原因是小分子蛋白能夠通過(guò)腎過(guò)濾的途徑快速消除。在血液中水力半徑超過(guò)白蛋白或者分子量大于66,000道爾頓(66kDa)的蛋白通常可以穩(wěn)定的保留在循環(huán)系統(tǒng)中，而小分子蛋白藥物卻會(huì)通過(guò)腎小球過(guò)濾被快速消除，因此為了維持在血液中的有效治療濃度，患者需要頻繁接受注射或者點(diǎn)滴。這種治療方式雖然能夠達(dá)到治療的目的，但是卻給患者帶來(lái)了嚴(yán)重的不便和痛苦，也嚴(yán)重影響了患者對(duì)于藥物治療的依從性，也提高了用藥成本。而且某些藥物長(zhǎng)期頻繁使用還有可能會(huì)產(chǎn)生一些副作用，如免疫反應(yīng)。
[0006]作為蛋白藥物的血管內(nèi)皮抑制素同樣存在半衰期短、體內(nèi)清除率高的缺點(diǎn)。目前臨床用藥手段主要為頻繁給藥以維持有效血藥濃度，通常為每天給藥，而且需要長(zhǎng)期用藥，這使得患者的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)都很大。本專利技術(shù)的目的就在于改善該蛋白的體內(nèi)代謝特征，使其具有更高的穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，甚至具有更高的療效，從而達(dá)到減少用藥頻率，降低用藥成本，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的目的。
[0007]用高分子聚合物對(duì)蛋白進(jìn)行修飾是改變和控制藥物的動(dòng)力學(xué)特性如半衰期、免疫學(xué)特征以及毒理特性的常用方法。其中聚乙二醇是應(yīng)用最為廣泛的一種雙親性高分子聚合物，具有溶解性好、生物相容性好、無(wú)毒無(wú)免疫原性的特點(diǎn)，是被包括美國(guó)FDA、中國(guó)SFDA在內(nèi)的很多國(guó)家和地區(qū)的藥品管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的可用于藥物制備的高分子。將蛋白質(zhì)與親水高分子如聚乙二醇偶聯(lián)，可以降低蛋白酶解、增加蛋白穩(wěn)定性、減少非特異性吸附和抗原性，當(dāng)偶聯(lián)物水力學(xué)半徑達(dá)到腎小球?yàn)V過(guò)下限時(shí)可以大大降低腎臟清除效率，是延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物體內(nèi)半衰期的有效方法(Gianfranco Pasut et.al.Advanced Drug Delivery Reviews 60(2008)69
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78；F.M.Veronese et al.Milestones in Drug Therapy 2009,11
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31)。隨著聚乙二醇修飾技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)分子上的多種基團(tuán)都可以被PEG修飾以滿足不同的需求。例如，利用單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺活性酯類修飾劑(如mPEG
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SC、mPEG
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SCM、mPEG
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SPA、mPEG
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NHS等)隨機(jī)修飾蛋白質(zhì)或者多肽N末端α氨基或者賴氨酸側(cè)鏈的ε氨基，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的多位點(diǎn)修飾。利用單甲氧基聚乙二醇醛(mPEG
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Aldehyde)在弱酸性條件下可以特異性的與蛋白質(zhì)或者多肽的N端α氨基反應(yīng)，形成不穩(wěn)定的希夫堿，通過(guò)氰基硼氫化鈉進(jìn)一步還原，生成穩(wěn)定的仲胺(secondary amine)實(shí)現(xiàn)對(duì)N末端的定點(diǎn)修飾。利用單甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺類修飾劑(如mPEG
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MAL、mPEG2
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MAL等)選擇性修飾蛋白或者多肽中游離半胱氨酸。截至目前聚乙二醇修飾技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于多種蛋白，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)上市的聚乙二醇修飾蛋白藥物有PEG
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腺苷脫亞胺酶(1990年)、PEG
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天冬酰胺酶(1994年)、PEG
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α2b干擾素(2001年)、PEG
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粒細(xì)胞集落刺激因子(2002年)、PEG
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α2a干擾素(2002年)、PEG
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α2a干擾素與利巴韋林混合制劑(2004年)、PEG
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紅細(xì)胞生成素(2007年)、PEG
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TNFα抗體(2008年)、PEG
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α2b干擾素與利巴韋林混合制劑(2008年)、PEG
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尿酸氧化酶(2010年)。正在進(jìn)行臨床研究的代表性的聚乙二醇修飾蛋白藥物有PEG
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精氨酸脫亞胺酶(Polaris Group，III期)、PEG
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生長(zhǎng)激素(長(zhǎng)春金賽藥業(yè)，III期)、PEG
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β1a干擾素(Biogen Idec，III期)等。
[0008]除了聚乙二醇修飾蛋白實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)藥物半衰期以外，還有其它高分子修飾劑可以使用，如葡聚糖、聚蔗糖、淀粉、聚丙氨酸、乙二酸與丙二酸的共聚物、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.血管內(nèi)皮抑制素類似物與聚乙二醇偶聯(lián)復(fù)合物；其中所述血管內(nèi)皮抑制素類似物在相應(yīng)于天然血管內(nèi)皮抑制素氨基酸序列SEQ ID NO.1的第96位的位置上具有賴氨酸殘基，而在任何其它位置上均不具有賴氨酸殘基；并且，所述血管內(nèi)皮抑制素類似物僅在該賴氨酸殘基上與聚乙二醇偶聯(lián)。2.血管內(nèi)皮抑制素類似物與聚乙二醇偶聯(lián)復(fù)合物；其中所述血管內(nèi)皮抑制素類似物在相應(yīng)于天然血管內(nèi)皮抑制素氨基酸序列SEQ ID NO.1的第96位的位置上具有賴氨酸殘基，而在任何其它位置上均不具有賴氨酸殘基；并且，所述血管內(nèi)皮抑制素類似物在N末端和該賴氨酸殘基上與聚乙二醇偶聯(lián)。3.權(quán)利要求1或2的偶聯(lián)復(fù)合物，其中所述血管內(nèi)皮抑制素類似物是天然血管內(nèi)皮抑制素氨基酸序列SEQ ID NO.1第76、107、118和184位的賴氨酸殘基發(fā)生突變而形成的。4.血管內(nèi)皮抑制素類似物與聚乙二醇偶聯(lián)復(fù)合物；其中所述血管內(nèi)皮抑制素類似物在相應(yīng)于天然血管內(nèi)皮抑制素氨基酸序列SEQ ID NO.1的第96位的位置上具有賴氨酸殘基，而在任何其它位置上均不具有賴氨酸殘基，并且所述血管內(nèi)皮抑制素類似物在其N端具有插入氨基酸序列的血管內(nèi)皮抑制素功能性變體；并且，所述血管內(nèi)皮抑制素類似物僅在該賴氨酸殘基上與聚乙二醇偶聯(lián)。5.血管內(nèi)皮抑制素類似物與聚乙二醇偶聯(lián)復(fù)合物；其中所述血管內(nèi)皮抑制素類似物在相應(yīng)于天然血管內(nèi)皮抑制素氨基酸序列SEQ ID NO.1的第96位的位置上具有賴氨酸殘基，而在任何其它位置上均不具有賴氨酸殘基，并且所述血管內(nèi)皮抑制素類似物在其N端具有插入氨基酸序列；并且，所述血管內(nèi)皮抑制素類似物在N末端和該賴氨酸殘基上與聚乙二醇偶聯(lián)。6.權(quán)利要求4或5的偶聯(lián)復(fù)合物，其中所述血管內(nèi)皮抑制素類似物是天然血管內(nèi)皮抑制素氨基酸序列SEQ ID NO.1的第76、107、118和184位的賴氨酸殘基發(fā)生突變，并且在其N端的甲硫氨酸M和組氨酸H之間插入GGSHHHHH而形成的。7.權(quán)利要求1、2、4或5的偶聯(lián)復(fù)合物，其中N端插入氨基酸序列是MGGSHHHHH。8.權(quán)利要求3或6任一項(xiàng)的偶聯(lián)復(fù)合物，其中天然血管內(nèi)皮抑制素氨基酸序列SEQ ID NO.1的第76、107、118和184位的賴氨酸殘基分別被突變?yōu)閄1、X3、X4、X5，其中X1、X3、X4或X5獨(dú)立地為除賴氨酸以外的任何一種天然氨基酸。9.權(quán)利要求8的偶聯(lián)復(fù)合物，其中X1、X3、X4或X5獨(dú)立地為水溶性氨基酸。10.權(quán)利要求9的偶聯(lián)復(fù)合物，其中X1、X3、X4或X5獨(dú)立地為精氨酸、組氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的任一種。11.權(quán)利要求10的偶聯(lián)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周代福，王文超，李輝，常國(guó)棟，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京普羅吉生物科技發(fā)展有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：