靶向禽流感病毒M2的多肽、流感疫苗及應用制造技術

本發明專利技術涉及流感疫苗技術領域，尤其涉及靶向禽流感病毒M2的多肽、流感疫苗及應用。該抗原肽具有如SEQ ID NO.1～5任一所示的氨基酸序列。該類抗原肽能夠有效地在體內產生免疫反應，具有較強的抗原性，能夠有效地誘導機體產生針對禽流感病毒M2特異性抗體和T細胞增殖應答，從而為機體提供的針對禽流感病毒M2引起相關疾病的免疫保護，提示該多肽可以作為一種抗原用于制備流感疫苗，具有廣泛的應用前景。具有廣泛的應用前景。具有廣泛的應用前景。

【技術實現步驟摘要】
靶向禽流感病毒M2的多肽、流感疫苗及應用


[0001]本專利技術涉及流感疫苗
，尤其涉及靶向禽流感病毒M2的多肽、流感疫苗及應用。

技術介紹

[0002]禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)的各種亞型引起的禽類疾病綜合征，幾乎所有的野生及家養禽類都可感染。根據病毒毒力的不同，可將其分為高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza,HPAI)、低致病性禽流感(Low Pathogenic Avian Influenza,LPAI)和非致病性禽流感三大類。根據病毒粒子表面的血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經氨酸酶(Neuraminidase,NA，可將其分為17個HA亞型和9個NA亞型。其中感染人的主要是H5N1、H9N2和H7N7亞型，感染禽類的主要是H5N1和H9N2亞型，感染豬的主要是H1N1和H3N2亞型。
[0003]其中，HA是流感病毒表面主要的保護性抗原之一，能誘導機體產生中和抗體，含有多個TB細胞表位，HA2位于HA的C端，含有高度保守的融合序列，基于HA2保守區域的通用疫苗研究一直是一個熱點。基質蛋白2(matrix protein 2,M2)是流感病毒表面的跨膜蛋白，由97個氨基酸組成，膜蛋白M2的氨基酸序列高度保守，以M2作為候選抗原制備成流感疫苗具有一定廣譜性保護功效，然而其在特異性和產生抗體水平上仍有待改善。

技術實現思路

[0004]為此，本專利技術提供了一類抗原肽，能夠靶向禽流感病毒M2的抗原肽、流感疫苗及應用，該類抗原肽能夠有效地在體內產生免疫反應，具有較強的抗原性，能夠有效地誘導機體產生針對禽流感病毒M2特異性抗體和T細胞增殖應答，從而為機體提供的針對禽流感病毒M2引起相關疾病的免疫保護，提示該多肽可以作為一種抗原用于制備流感疫苗，具有廣泛的應用前景。
[0005]第一方面，本專利技術實施例公開了一種抗原肽，具有如SEQ ID NO.1～5所示的氨基酸序列。
[0006]第二方面，本專利技術實施例公開了一種抗原肽的制備方法，所述抗原肽具有如SEQ ID NO.1～5所示的氨基酸序列，所述制備方法包括：
[0007]分別合成第一肽段和第二肽段，所述第一肽段具有如SEQ ID NO.7～9任一所示的氨基酸序列，所述第二肽段具有如SEQ ID NO.10～24所示任一的氨基酸序列；
[0008]將所述第一肽段和所述第二肽段經過TAEC連接反應得到具有全長序列的抗原肽。
[0009]在本專利技術實施例中，第一肽段的合成方法包括：將所述第一肽段的序列以Fmoc
?
蛋氨酸作為起點，采用固相合成方法，在偶連試劑的作用下依序連接，合成多肽酰肼衍生物Fmoc
?
第一肽段
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NH
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NH2。
[0010]在本專利技術實施例中，第二肽段的合成方法包括：獲得第二肽段的氮端第1個具有Boc保護基團的氨基酸，將其與氯甲酸乙酯反應形成活性中間體，然后順序與第二肽段中的
氨基酸縮合反應，得到合成具有Boc保護基團的二肽；將Boc保護基團的二肽作為原料，重復上述步驟直至合成具有全長序列的第二肽段，再進行脫除Boc反應，得到第二肽段。
[0011]在本專利技術實施例中，所述第一肽段具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，所述第二肽段具有如SEQ ID NO.10～14所示任一的氨基酸序列。
[0012]在本專利技術實施例中，所述第一肽段具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，所述第二肽段具有如SEQ ID NO.15～19所示任一的氨基酸序列。
[0013]在本專利技術實施例中，所述第一肽段具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，所述第二肽段具有如SEQ ID NO.20～24所示任一的氨基酸序列。
[0014]第三方面，本專利技術實施例公開了一種嵌合體，其包括第一方面的抗原肽以及與所述抗原肽偶聯的載體蛋白。
[0015]第四方面，本專利技術實施例公開了一種多肽疫苗，其包括第一方面所述的抗原肽與用于提高抗原肽穩定性和免疫原性的載體，所述載體包括載體蛋白和疫苗佐劑，所述載體蛋白用于與所述抗原體偶聯形成嵌合體，所述疫苗佐劑用于對所述嵌合體進行吸附形成穩定的納米懸浮液。
[0016]第五方面，本專利技術實施例公開了第一方面所述的抗原肽、第二方面所述的制備方法制得的抗原肽在制備流感疫苗中的應用。
[0017]與現有技術相比，本專利技術至少具有以下有益效果之一：
[0018]本專利技術實施例公開了一類抗原肽能夠有效地在體內產生免疫反應，具有較強的抗原性，能夠有效地誘導機體產生針對禽流感病毒M2特異性抗體和T細胞增殖應答，從而為機體提供的針對禽流感病毒M2引起相關疾病的免疫保護，提示該多肽可以作為一種抗原用于制備流感疫苗，具有廣泛的應用前景。
[0019]進一步將其與載體蛋白偶聯成為嵌合體和多肽疫苗，并將對應的抗原肽、嵌合體和多肽疫苗進行體外分析發現，以實施例提供的抗原肽制備的嵌合體，以實施例提供的抗原肽制備的多肽疫苗分別作為供試品具有更強的抗原性。通過體內試驗發現，以實施例提供的抗原肽制備的嵌合體，以實施例提供的抗原肽制備的多肽疫苗能夠在小鼠體內高水平的特異性抗體，并未其提供進一步病毒攻擊的保護，降低死亡率，為其發展成為流感疫苗提供堅實的研究支持。
附圖說明
[0020]圖1為本專利技術實施例1提供的抗原肽的第一肽段的HPLC圖(左圖)和質譜圖(右圖)。
[0021]圖2為本專利技術實施例1提供的抗原肽的第二肽段的HPLC圖(左圖)和質譜圖(右圖)。
[0022]圖3為本專利技術實施例1提供的抗原肽全長肽段的HPLC圖(左圖)和質譜圖(右圖)。
[0023]圖4為本專利技術實施例1提供的抗原肽(泳道1)、嵌合體(泳道2)和多肽疫苗(泳道3)，以及對比例1提供的抗原肽(泳道4)、嵌合體(泳道5)和多肽疫苗(泳道6)分別與M2抗體特異性結合的Western blotting結果圖，35KD左右為結合的目的條帶。
[0024]圖5為本專利技術提供的體內實驗中，對照組(A)、抗原肽組實施例1(B)、嵌合體肽組實施例1(C)和多肽疫苗組實施例1(D)小鼠肺臟HE染色圖。
具體實施方式
[0025]為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例對本專利技術進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。本專利技術中未詳細單獨說明的試劑均為常規試劑，均可從商業途徑獲得；未詳細特別說明的方法均為常規實驗方法，可從現有技術中獲知。
[0026]需要說明的是，本專利技術的說明書和權利要求書及上述附圖中的術語“第一”、“第二”等是用于區別類似的對象，而不必用于描述特定的順序或先后次序，也不對其后的技術特征起到實質的限定作用。應該理解這樣使用的數據在適當情況下可以互換，以本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種抗原肽，其特征在于，所述抗原肽靶向禽流感病毒M2，所述抗原肽具有如SEQ ID NO.1～5任一所示的氨基酸序列。2.一種抗原肽的制備方法，其特征在于，所述抗原肽具有如SEQ ID NO.1～5任一所示的氨基酸序列，所述制備方法包括：分別合成第一肽段和第二肽段，所述第一肽段具有如SEQ ID NO.7～9任一所示的氨基酸序列，所述第二肽段具有如SEQ ID NO.10～24所示任一的氨基酸序列；將所述第一肽段和所述第二肽段經過TAEC連接反應得到具有全長序列的抗原肽。3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，第一肽段的合成方法包括：將所述第一肽段的序列以Fmoc
?
蛋氨酸作為起點，采用固相合成方法，在偶連試劑的作用下依序連接，合成多肽酰肼衍生物Fmoc
?
第一肽段
?
NH
?
NH2。4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，第二肽段的合成方法包括：獲得所述第二肽段的氮端第1個具有Boc保護基團的氨基酸，將其與氯甲酸乙酯反應形成活性中間體，然后順序與第二肽段中的氨基酸縮合反應，得到合成具有Boc保護基團的二肽；將Boc保護基團的二肽...

【專利技術屬性】
技術研發人員：付麗麗，王海龍，劉曉滿，王雅君，張巖，李伯彬，
申請(專利權)人：北京華諾泰生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：