一種衍生自嗜中性細(xì)胞趨化因子的抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開一種衍生自嗜中性細(xì)胞趨化因子抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)畜牧獸醫(yī)應(yīng)用領(lǐng)域，其序列如SEQ ID No.1所示，制備方法：通過(guò)在具有嗜中性細(xì)胞趨化作用的六肽的碳端用GGG片段連接pH響應(yīng)親疏水交替肽模板(YXHAXYH)2，雜合得到多肽KWH，用固相化學(xué)合成法合成該多肽KWH；進(jìn)一步的，提供該抗菌肽在制備治療革蘭氏陰性菌感染性疾病的藥物中的應(yīng)用；該抗菌肽具有較低的溶血活性和真核細(xì)胞毒性，該抗菌肽在128μmol/L濃度下未能引起10％的紅細(xì)胞溶血；豬小腸上皮細(xì)胞IPEC

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種衍生自嗜中性細(xì)胞趨化因子的抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)屬于農(nóng)業(yè)畜牧獸醫(yī)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種衍生自嗜中性細(xì)胞趨化因子的抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用。

技術(shù)介紹

[0002]抗菌肽是生物體內(nèi)廣泛存在的一種具有抗菌作用的活性多肽，是生物非特異性防御系統(tǒng)的免疫應(yīng)答產(chǎn)物，在動(dòng)物，尤其是獲得性免疫系統(tǒng)不健全的動(dòng)物抵御外界微生物侵襲的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。抗菌肽殺菌速度快且不易產(chǎn)生耐藥性。因此，抗菌肽的研究已成為藥物開發(fā)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在細(xì)菌感染的藥物開發(fā)方面有著廣闊的應(yīng)用前景。天然抗菌肽存在一些不足，這些不足限制了其作為抗生素替代物的應(yīng)用。對(duì)肽分子進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)和改造是應(yīng)用抗菌肽的有效途徑之一。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，在病灶部位的微環(huán)境中常常伴隨著pH的下降，pH響應(yīng)性為抗菌肽的設(shè)計(jì)或改造中值得考慮的一個(gè)因素。
[0003]巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等吞噬細(xì)胞為代表的固有免疫在宿主防御感染中起早期第一道防線的關(guān)鍵作用。宿主固有免疫的適當(dāng)激活有利于對(duì)細(xì)菌的局部清除；因此，調(diào)節(jié)宿主固有免疫應(yīng)答是對(duì)抗菌策略的一種有益補(bǔ)充。設(shè)計(jì)能結(jié)合固有免疫調(diào)節(jié)功能的抗菌肽為預(yù)防和治療細(xì)菌感染提供了一種有吸引力的思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0004]基于以上問(wèn)題，本專利技術(shù)的目的在于公開一種衍生自嗜中性細(xì)胞趨化因子的抗菌肽，是基于對(duì)具有嗜中性細(xì)胞趨化作用的六肽進(jìn)行改造獲得一種新的抗菌肽，對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌具有較高的殺菌活性，且在酸性環(huán)境下殺菌效率較高，該抗菌肽具有較高的細(xì)胞選擇性，及較低的溶血活性。
[0005]本專利技術(shù)的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種衍生自嗜中性細(xì)胞趨化因子的抗菌肽KWH，其序列如SEQ ID No.1所示，分子式如式(Ⅰ)所示，
[0006][0007]本專利技術(shù)的另一目的是提供如上所述的一種衍生自嗜中性細(xì)胞趨化因子抗菌肽KWH的制備方法，方法如下：在具有嗜中性細(xì)胞趨化作用的六肽，其序列為：MMHWFM的碳端使用GGG片段連接pH響應(yīng)親疏水交替肽模板(YXHAXYH)2，其中，X為疏水性色氨酸，Y為親水性賴氨酸，H為pH響應(yīng)性組氨酸，A為丙氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽；用固相化學(xué)合成法合成該多肽KWH，其正電荷含量為4個(gè)，疏水值為0.187；再經(jīng)過(guò)抗菌活性的測(cè)定、
溶血活性的測(cè)定及真核細(xì)胞毒性的測(cè)定，最終命名為抗菌肽KWH。
[0008]本專利技術(shù)的另一目的是提供一種衍生自嗜中性細(xì)胞趨化因子抗菌肽KWH在制備治療革蘭氏陰性菌感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0009]進(jìn)一步的，所述的革蘭氏陰性菌為：大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌或綠膿桿菌。
[0010]本專利技術(shù)的有益效果及優(yōu)點(diǎn)如下：本專利技術(shù)提高了具有嗜中性細(xì)胞趨化作用的六肽針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的殺菌活性，且殺菌活性在酸性pH情況下顯著增強(qiáng)。抗菌肽KWH細(xì)胞選擇性好，在具有較高殺菌活性的同時(shí)，具有較低的溶血活性。對(duì)抗菌肽KWH進(jìn)行抗菌和溶血活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)KWH對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌或綠膿桿菌具有高效的抑制作用，且具有較低的溶血活性和真核細(xì)胞毒性，該抗菌肽KWH在128μmol/L濃度下造成8.05％的紅細(xì)胞溶血，未能引起10％的紅細(xì)胞溶血；且在64μmol/L肽濃度下豬小腸上皮細(xì)胞IPEC
?
J2細(xì)胞的存活率127.7％。綜上所述，抗菌肽KWH是一種具有較高應(yīng)用價(jià)值的抗菌肽，具備成為抗生素替代物的發(fā)展?jié)摿Α?br/>附圖說(shuō)明
[0011]圖1為本專利技術(shù)的抗菌肽KWH的高效液相色譜圖。
[0012]圖2為本專利技術(shù)的抗菌肽KWH的高效液相質(zhì)譜圖。
[0013]圖3為本專利技術(shù)的抗菌肽KWH與蜂毒素ME的溶血活性對(duì)比圖。
[0014]圖4為本專利技術(shù)的抗菌肽KWH和蜂毒素ME對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞IPEC
?
J2的細(xì)胞毒性影響對(duì)比圖。
具體實(shí)施方式
[0015]下面根據(jù)說(shuō)明書附圖舉例對(duì)本專利技術(shù)做進(jìn)一步的說(shuō)明：
[0016]實(shí)施例1
[0017]多肽KWH的設(shè)計(jì)
[0018]具有嗜中性細(xì)胞趨化作用六肽的氨基酸序列為：MMHWFM；通過(guò)在具有嗜中性細(xì)胞趨化作用六肽的碳端使用GGG片段連接pH響應(yīng)親疏水交替肽模板(YXHAXYH)2，其中，X為疏水性色氨酸，Y為親水性賴氨酸，H為pH響應(yīng)性組氨酸，A為丙氨酸，得到多肽KWH，其氨基酸序列為KWHAWKHKWHAWKHGGGMMHWFM，為α螺旋結(jié)構(gòu)；多肽KWH的氨基酸序列如表1所示。
[0019]表1氨基酸序列
[0020][0021]分子式如式(Ⅰ)所示，
[0022][0023]多肽KWH的電荷數(shù)為+4，疏水值為0.187。
[0024]實(shí)施例2
[0025]固相化學(xué)合成法合成多肽KWH
[0026]1、多肽的制備從C端到N端逐一進(jìn)行，通過(guò)多肽合成儀來(lái)完成。首先將Fmoc
?
X(X是每個(gè)多肽的C端第一個(gè)氨基酸)接入到Wang樹脂，然后脫去Fmoc基團(tuán)后得到X
?
Wang樹脂；再將Fmoc
?
Y
?
Trt
?
OH(9
?
芴甲氧羧基
?
三甲基
?
Y，Y為每個(gè)多肽C端第二個(gè)氨基酸)；按照這個(gè)程序依次從C端合成到N端，直至合成完畢，得到脫去Fmoc基團(tuán)的側(cè)鏈保護(hù)的樹脂；
[0027]2、在上述得到的肽樹脂中，加入切割試劑，20℃避光下反應(yīng)2h，過(guò)濾；沉淀TFA(三氟乙酸洗滌，將洗液與上述濾液混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，再加入10倍左右體積的預(yù)冷無(wú)水乙醚，
?
20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g離心10min，收集沉淀，再用無(wú)水乙醚洗滌沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割試劑由TFA、水和TIS(三異丙基氯硅烷)按照質(zhì)量比95:2.5:2.5混合而成；
[0028]3、使用0.2mol/L硫酸鈉(磷酸調(diào)節(jié)至pH7.5)進(jìn)行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，過(guò)濾，C18反相常壓柱，采用梯度洗脫(洗脫劑為甲醇和硫酸鈉水溶液按照體積比為30:70～70:30混合)，流速為1mL/min，檢測(cè)波為220nm，收集主峰，凍干；再利用反相C18柱進(jìn)一步純化，洗脫液A為0.1％TFA/水溶液；洗脫液B為0.1％TFA/乙腈溶液，洗脫濃度為25％B～40％B，洗脫時(shí)間為12min，流速為1mL/min，再同上收集主峰，凍干；
[0029]4、多肽的鑒定：將上述得到的多肽經(jīng)過(guò)電噴霧質(zhì)譜法分析，質(zhì)譜圖中顯示的分子量(如圖1、2所示)與表1中的理論分子量基本一致，多肽的純度大于95％。
[0030]實(shí)施例3
[0031]多肽KWH抗菌活性的測(cè)定
[0032]1、抗菌活性的測(cè)定：利用微量肉湯稀釋法測(cè)定2種多肽：KWH和ME的最小抑菌濃度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作為稀釋液，使用二倍稀釋法依次配置系列梯度的多肽KWH溶液。取上述溶液100μL置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后分別添本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種衍生自嗜中性細(xì)胞趨化因子的抗菌肽KWH，其特征在于，其序列如SEQ ID No.1所示，分子式如式(Ⅰ)所示，2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種衍生自嗜中性細(xì)胞趨化因子抗菌肽KWH的制備方法，其特征在于，方法如下：通過(guò)在具有嗜中性細(xì)胞趨化作用的六肽，其序列為：MMHWFM的碳端用GGG片段連接pH響應(yīng)親疏水交替肽模板(YXHAXYH)2，其中，X為疏水性色氨酸，Y為親水性賴氨酸，H為pH響應(yīng)性組氨酸，A為丙氨酸，得到氨基酸序列如SEQ I...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：董娜，朱允慧，閆健銘，徐英晗，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：