一種單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。所述構(gòu)建方法包括在beads上連接barcode序列，將連接有barcode序列的beads、油相和細(xì)胞混合后包裹形成待測油包水；針對(duì)所述待測油包水提取DNA之后進(jìn)行ONT檢測。本發(fā)明專利技術(shù)通過在建庫時(shí)，采用帶有barcode序列的beads給每個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組加上不同barcode標(biāo)記，在測序后可以進(jìn)行快速的數(shù)據(jù)篩選，這使得擴(kuò)增后的全長基因不需打斷，可以直接進(jìn)行ONT平臺(tái)測序，較大程度上提高了檢測效率和準(zhǔn)確率。了檢測效率和準(zhǔn)確率。了檢測效率和準(zhǔn)確率。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)涉及基因工程
，尤其涉及一種單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

技術(shù)介紹

[0002]傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測序得到的是一群細(xì)胞基因表達(dá)的的平均水平，這種方式會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間的異質(zhì)性被掩蓋，難以區(qū)分不同細(xì)胞的基因組差異。而現(xiàn)有的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序能夠測定一群細(xì)胞中單個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)水平，從大量細(xì)胞中篩選出異質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究。但是基于流式細(xì)胞儀和激光捕獲纖維切割等技術(shù)的單細(xì)胞篩選及測序技術(shù)具有成本高、通量低的缺點(diǎn)；而基于barcode標(biāo)簽的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)讀長短。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0003]為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本專利技術(shù)提供一種單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建方法。通過給不同細(xì)胞帶上不同baorcod序列便于測序后數(shù)據(jù)篩選；擴(kuò)增后的全長基因不需打斷，可直接用ONT平臺(tái)測序。
[0004]第一方面，本專利技術(shù)提供一種單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建方法，包括：
[0005]在beads上連接barcode序列，將連接有barcode序列的beads、油相和細(xì)胞混合后包裹形成待測油包水；針對(duì)所述待測油包水提取DNA之后進(jìn)行ONT檢測。
[0006]進(jìn)一步地，所述連接有barcode序列beads、油相和細(xì)胞的體積比為(5～10):(20～30):(40～50)。
[0007]進(jìn)一步地，所述beads上還連接有反轉(zhuǎn)錄引物；所述反轉(zhuǎn)錄引物包括如下核苷酸序列：
[0008]5’?
CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
?3’
。
[0009]進(jìn)一步地，所述提取DNA包括反轉(zhuǎn)錄、破油純化和PCR擴(kuò)增。
[0010]進(jìn)一步地，所述反轉(zhuǎn)錄中使用的RTmix包括：0.4～0.6％ BSA和0.1～0.3％Tween 20。
[0011]進(jìn)一步地，如上BSA和Tween20均為配置好的，質(zhì)量或體積百分含量為10％的BSA和Tween20。
[0012]本專利技術(shù)在反轉(zhuǎn)錄過程中，在RT mix中加入BSA，其一方面可以保護(hù)逆轉(zhuǎn)錄酶，增加酶的穩(wěn)定性，又能夠?qū)?xì)胞起到生理和機(jī)械保護(hù)的作用。在這種情況下對(duì)于細(xì)胞活性的要求降低，一般情況下，構(gòu)建單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫對(duì)細(xì)胞活性要求80％以上，而在RT mix中加入BSA，使得本專利技術(shù)對(duì)于對(duì)細(xì)胞活性要求在60％以上即可。
[0013]此外，本專利技術(shù)還在RTmix中加入Tween 20，通常情況下，Tween20通常被認(rèn)為對(duì)細(xì)胞有破壞作用，但是本專利技術(shù)發(fā)現(xiàn)低濃度Tween20對(duì)細(xì)胞活性影響較小(加上本專利技術(shù)加入BSA之后放寬了對(duì)細(xì)胞活性的要求)，而且在加入Tween20之后增加了細(xì)胞相流動(dòng)性，縮短了油包
Technologies 2100Bioanalyzerd購自安捷倫；Amp Mix、末端修復(fù)試劑、接頭連接試劑購自NEB；無核酶水購自天根；80％乙醇溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0030]實(shí)施例1
[0031]1、將單細(xì)胞懸液與逆轉(zhuǎn)錄試劑混合，制備細(xì)胞相
[0032]1.1按照下表配制RT mix：
[0033]表1 RT mix配方
[0034]試劑用量/ul5
×
RT Buffer16dNTP3RNaseOUT1TSO110％BSA410％Tween201.6SuperScript III reverse transcriptase4
[0035]TSO引物序列：GGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG。
[0036]1.2制備細(xì)胞mix
[0037]根據(jù)要檢測的細(xì)胞量(1
?
2萬個(gè)細(xì)胞)及細(xì)胞濃度配制細(xì)胞mix體系(細(xì)胞采用活性在60％以上的細(xì)胞)：
[0038]表2細(xì)胞mix體系
[0039]試劑用量/ul細(xì)胞X細(xì)胞培養(yǎng)液49.4
?
X
[0040]其中細(xì)胞培養(yǎng)液指DMEM/MEM/1640等細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0041]2、制備油包水，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄
[0042]2.1加入細(xì)胞相、DG1000
?
3'gel beads及Partitioning Oil。加入量及位置，見圖1(細(xì)胞相由如上RT mix和細(xì)胞mix組成，共80μL，上樣75μL)。DG1000
?
3'gel beads中引物序列：
[0043]CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN。
[0044]2.2制備油包水
[0045]將芯片放入百創(chuàng)DG1000儀器中，等待油包水生成。
[0046]2.3進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄
[0047]將生成的油包水全部轉(zhuǎn)移到PCR管中，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
[0048]反轉(zhuǎn)錄體系如下：
[0049]表3反轉(zhuǎn)錄體系
[0050]溫度時(shí)間50℃90min85℃5min4℃Hold
[0051]3、樣品破油純化，進(jìn)行擴(kuò)增
[0052]3.1破油
[0053]取出PCR管，貼壁緩慢加入100ul破油試劑，靜置30s后油包水溶解，上層溶液透明。
[0054]3.2純化
[0055]3.2.1棄去下層溶液，向管中加入194ul純化試劑及6ul Dynabeads磁珠。
[0056]3.2.2移液槍混勻，靜置5min。
[0057]3.2.3移液槍再次混勻，靜置5min。
[0058]3.2.4將PCR管置于磁力架上，待液體澄清后洗去上清，加入300ul 80％乙醇溶液，30s洗去上清；再加入200ul 80％乙醇溶液，30s洗去上清。瞬時(shí)離心后加PCR管置于磁力架上，吸去殘留的乙醇溶液。
[0059]3.2.5靜置1min后，加入23.5ul無核酸酶水，吹勻后室溫靜置5min。
[0060]3.2.6將PCR管置于磁力架上靜置2min。
[0061]3.3擴(kuò)增
[0062]配制PCR mix：
[0063]表4 PCR mix配方
[0064]試劑用量/ulAmp Mix25cDNA Primers2
[0065]cDNA引物序列：
[0066]F：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
[0067]R：CTACACGACGCTCTTCCGAT。
[0068]從磁力架上的PCR管中取23ul RT產(chǎn)物加入PCR mix中混勻，瞬時(shí)離心后置于PCR儀中，PCR儀中的反應(yīng)程序如下：
[0069]表5 PCR反應(yīng)程序
[0070][0071]4、PCR產(chǎn)物純化
[0072]4.1SPRI磁珠渦旋混勻后取30ul加入PCR產(chǎn)物中，吹打混勻，靜置5min。
[0073]4.2將PCR管置于磁力架上，靜置至溶液澄本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：在beads上連接barcode序列，將連接有barcode序列的beads、油相和細(xì)胞混合后包裹形成待測油包水；針對(duì)所述待測油包水提取DNA之后進(jìn)行ONT檢測。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述連接有barcode序列beads、油相和細(xì)胞的體積比為(5～10):(20～30):(40～50)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述beads上還連接有反轉(zhuǎn)錄引物；所述反轉(zhuǎn)錄引物包括如下核苷酸序列：5
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。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述提...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄭洪坤，劉敏，衣春霖，張?zhí)?/a>，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京百邁客生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：