本發(fā)明專利技術提供了一種將過表達蛋白錨定于細胞膜的微小蛋白及其應用，屬于分子生物技術領域。本發(fā)明專利技術的將過表達蛋白錨定于細胞膜的微小蛋白為(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的微小蛋白；(b)將SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有將過表達蛋白錨定于細胞膜的微小蛋白。本發(fā)明專利技術的微小蛋白不僅為外源蛋白提供了定向表達的方法，而且為在細胞表面定位表達外源蛋白用于生物轉化提供工具。達外源蛋白用于生物轉化提供工具。達外源蛋白用于生物轉化提供工具。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
一種將過表達蛋白錨定于細胞膜的微小蛋白及其應用
[0001]本專利技術屬于分子生物
，具體涉及一種將過表達蛋白錨定于細胞膜的微小蛋白及其應用。
技術介紹
[0002]神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病是以自體免疫細胞、免疫分子等攻擊神經(jīng)系統(tǒng)為主要病理機制的自身免疫性疾病，可發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)
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肌肉接頭處，導致神經(jīng)元或軸索損傷、髓鞘脫失、神經(jīng)
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肌肉接頭破壞等病理改變。自身抗體的產(chǎn)生是自身免疫病的基本特征之一，因而自身抗體本身就成為大多數(shù)自身免疫病的血清學標記物。早期診斷對管理自身免疫疾病來說非常重要。在早期階段發(fā)現(xiàn)自身免疫疾病可避免或延遲標的器官或組織發(fā)生無法補救的損傷。自身免疫病體外診斷一般是通過體外檢測疾病相關自身抗體來實現(xiàn)，主流診斷方法有：免疫印跡法、間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫法、化學發(fā)光法、膠體金法等。目前基于細胞的間接免疫熒光(Cell
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Base assay,CBA)檢測法已成為國際和國內的神經(jīng)內科專家診斷視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病、自身免疫性腦脊髓炎等自身免疫性疾病的共識和推薦。
[0003]CBA檢測法是將特定抗原在細胞內過表達，以細胞為固相基質，加入待測一抗，通過熒光素標記的第二抗體IgG，來檢測待測樣本是否含有特定的特異性抗體。在細胞水平的蛋白表達可為抗原形成提供更多類似于體內表達的環(huán)境，避免蛋白提取分離過程帶來的結構變化等問題，可極大的避免使用WB、ELISA等檢測方法造成的假陰性和假陽性結果。
[0004]隨著自身免疫性疾病研究的深入，越來越多的自身免疫性疾病相關特異性靶標被發(fā)現(xiàn)并報道，例如中樞神經(jīng)脫髓鞘靶標AQP4、MOG等，自免疫性腦炎靶標NMDAR、AMPAR等。不同靶標在細胞內表達后的定位不同，對于在膜上表達的靶標例如AQP4，CBA法簡單方便、具有較好明敏度和特異性，但對于非膜蛋白例如GFAP、LGI1等在胞內表達或分泌型蛋白，過表達的抗原不能定位于細胞膜上。為使抗體能順利通過細胞膜，需要對細胞膜進行打孔或透膜處理，即增加了檢測的繁瑣性、同時會提高假陰性和假陽性風險。因此如何將過表達的特定抗原錨定在膜上表達是亟需解決的問題。
技術實現(xiàn)思路
[0005]針對上述問題，本專利技術的目的在于提供一種將過表達蛋白錨定于細胞膜的微小蛋白及其應用，本專利技術的微小蛋白不僅為外源蛋白提供了定向表達的方法，而且為在細胞表面定位表達外源蛋白用于生物轉化提供工具。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本專利技術采取的技術方案為：一種將過表達蛋白錨定于細胞膜的微小蛋白，所述微小蛋白為(a)或(b)：
[0007](a)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的微小蛋白；
[0008](b)將SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有將過表達蛋白錨定于細胞膜的微小蛋白。
[0009]研究表明，Helical結構是跨膜區(qū)蛋白的常見基序結構之一，約20～25個氨基酸殘基。將帶有Helical結構且長度適中的單次跨膜蛋白與特定抗原融合表達，有助于外源蛋白錨定在細胞膜上本專利技術的微小蛋白。本專利技術的微小蛋白包含59個氨基酸，第30
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50氨基酸為具有Helical結構的跨膜區(qū)，第1
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29氨基酸為膜外區(qū)，第51
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59氨基酸為胞內段。本專利技術的微小蛋白有助于驅使融合表達的靶標蛋白錨定在細胞膜上，增強靶標蛋白在細胞膜上定位的有效性，從而降低CBA法檢測非膜蛋白抗原時出現(xiàn)假陰性和假陽性的風險。
[0010]本專利技術還提供一種編碼權利要求1所述微小蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列為(a)、(b)或(c)：
[0011](a)如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
[0012](b)與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列雜交且編碼具有將過表達蛋白錨定于細胞膜的核苷酸序列；
[0013](c)與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有80％以上同源性且編碼具有Helical跨膜結構域蛋白的核苷酸序列。
[0014]本專利技術還提供一種重組融合蛋白，含有所述的將過表達蛋白錨定于細胞膜的微小蛋白。將特定的靶標抗原基因與本專利技術的微小蛋白融合表達，使表達后的抗原錨定在細胞膜上，在抗體檢測時，抗體無須穿過細胞膜則可其結合，可降低CBA抗體檢測操作步驟、同時能降低假陽性的風險。
[0015]本專利技術還提供一種含有所述的基因的重組表達載體、重組菌或轉基因細胞系。
[0016]本專利技術還提供所述的微小蛋白在將過表達蛋白錨定于細胞膜中的應用。
[0017]本專利技術還提供所述的重組融合蛋白在將過表達蛋白錨定于細胞膜中的應用。
[0018]作為本專利技術所述的應用的優(yōu)選實施方式，所述細胞包括293T細胞、Hela細胞或CHO細胞。
[0019]本專利技術還提供一種將過表達蛋白錨定于細胞膜的方法，一種將過表達蛋白錨定于細胞膜的方法，將所述的微小蛋白作為錨膜結構將過表達蛋白錨定于細胞膜。
[0020]作為本專利技術所述方法的優(yōu)選實施方式，具體包括以下步驟：
[0021](1)將融合基因導入靶細胞中，從而將目標蛋白錨定于靶細胞的細胞膜上；所述融合基因自上游至下游依次包括編碼微小蛋白基因序列和編碼目標蛋白的基因序列；
[0022](2)將融合基因導入靶細胞中，從而將目標蛋白錨定于靶細胞的細胞膜上；所述融合基因自上游至下游依次包括編碼目標蛋白的基因序列和編碼微小蛋白基因序列。
[0023]本專利技術的有益效果為：本專利技術提供了一種將過表達蛋白錨定于細胞膜的微小蛋白及其應用。本專利技術的微小蛋白不僅為外源蛋白提供了定向表達的方法，而且為在細胞表面定位表達外源蛋白用于生物轉化提供工具；本專利技術的將過表達蛋白錨定于細胞膜的方法，為CBA法檢測非膜蛋白抗原LGI1有效降低了出現(xiàn)假陰性的風險。
附圖說明
[0024]圖1為重組片段A的PCR結果圖；
[0025]圖2為實施例1中對照組和實驗組EGFP蛋白的熒光顯微圖；
[0026]圖3為重組片段B的PCR結果圖；
[0027]圖4為實施例2對照組和實驗組質粒表達和LGI1定位情況圖。
具體實施方式
[0028]為了更加簡潔明了的展示本專利技術的技術方案、目的和優(yōu)點，下面結合具體實施例和附圖詳細說明本專利技術的技術方案。
[0029]實施例1EGFP與SIM30融合表達在293T細胞中的定位
[0030]一、構建EGFP
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Sim30融合表達質粒
[0031]1、獲得目的片段
[0032]微小蛋白Sim30的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，相關引物由廣州擎科生物技術有限公司合成，設計EGFP
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SIM30重組引物EGF本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種將過表達蛋白錨定于細胞膜的微小蛋白，其特征在于，所述微小蛋白為(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的微小蛋白；(b)將SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有將過表達蛋白錨定于細胞膜的微小蛋白。2.一種編碼權利要求1所述微小蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列為(a)、(b)或(c)：(a)如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列雜交且編碼具有將過表達蛋白錨定于細胞膜的核苷酸序列；(c)與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有80％以上同源性且編碼具有Helical跨膜結構域蛋白的核苷酸序列。3.一種重組融合蛋白，其特征在于，含有權利要求1...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：朱利軍，曾毅，郭燕珊，李瑩，朱嘉怡，劉永初，李陽，劉陽，
申請(專利權)人：深圳安吉康爾醫(yī)學檢驗實驗室，
類型：發(fā)明
國別省市：
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