中腦類器官及其高速大規模制造方法、利用它篩選神經毒性物質和篩選多巴胺能神經元相關疾病藥物的方法技術

本發明專利技術涉及中腦類器官及其制造方法、利用它的神經毒性物質的篩選方法以及多巴胺能神經元相關疾病的藥物篩選方法，其中該制造方法可以高速、快速制造類器官，從而實現快速的藥物篩選，阻斷異常分化，最大限度地減少死核現象，并減少類器官之間的變異，因此可以有效地用于類器官的生產。用于類器官的生產。用于類器官的生產。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】中腦類器官及其高速大規模制造方法、利用它篩選神經毒性物質和篩選多巴胺能神經元相關疾病藥物的方法


[0001]本專利技術涉及中腦(Midbrain)類器官的高速大規模制造方法、利用它的神經毒性物質的篩選方法以及多巴胺能神經元相關疾病治療的藥物篩選(drug screening)方法，更具體地，涉及制造中腦類器官所需的初始細胞數(starting cell number)和培養方式(culture format)，通過調節，可以高速大規模制造質量優良、個體間變異少的中腦類器官。

技術介紹

[0002]類器官是一種新的干細胞分化技術，利用干細胞的分化能力(differentiation)、自我再生能力(self
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renewal)、自我組織能力(self
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organization)，通過三維培養再現與體內器官相似的細胞組成和結構。此外，通過生產患者定制的類器官，可以低成本、短期內生產對多種疾病的患者定制的治療藥物，該技術被評價為有前景的技術。
[0003]最近報告了反映各種腦部特性的腦類器官的生產，使用腦類器官研究寨卡病毒(ZIKA virus)或利用患者來源的腦類器官的疾病模擬研究和新藥開發研究正在積極進行。
[0004]但是，生產患者定制的類器官需要很多費用和很長時間。如圖1所示，真正患者來源的誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell；iPSCs)的生產通常需要6～8周以上，其效率通常也很低，達到0.02％左右。此外，生產類器官所需的時間因各器官而異，但大部分需要3至6個月以上。因此，對患有退行性腦病年齡較高的患者和其他急需藥物治療的患者來說，開發患者定制新藥等在現實上是困難的。另外，包括腦類器官在內的大部分類器官生產都存在以下問題，這些問題是類器官研究的實用化或產業化必須解決的問題。
[0005]第一，生產類器官需要很多費用和很長時間。
[0006]為了分化和成熟，需要氧氣和營養物質供應到類器官內部，為此，大多數情況下使用震蕩生物反應器(shaking bioreactor)，以提供必不可少的CO2孵化器內持續的震蕩和分化，為了類器官長期的特異性分化，必須用昂貴的分化促進因子長期處理。因此，生產長期特異的類器官需要花費大量的費用(圖1)。
[0007]第二，類器官間個體間變異(batch variation)非常嚴重(圖2)，因此，在利用類器官進行疾病模擬研究和新藥篩選研究中，可能會產生不準確的結果。
[0008]第三，類器官分化時會產生稱為“異常分化(out
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growth)”的異常組織，這是阻礙類器官質量和功能性等的嚴重問題(圖2)。
[0009]第四，目前類器官內部沒有血管，因此氧氣和營養物質無法正常傳遞到類器官的核心，導致內部細胞死亡的“死核”(dead core)現象很普遍，這阻礙了類器官的成熟，因此是必須解決的問題(圖2)。
[0010]第五，基于類器官的高速批量篩選(high throughput screening；HTS)；為了通過HTS進行藥物篩選(drug screening)或藥物再制造(drug repositioning)研究，需要開發符合HTS模式(format)的類器官大規模生產系統。此外，在HTS模式中類器官的生產和藥物
篩選一體化、可進行的一步式類器官生產及新藥開發系統的開發是今后通過類器官自動化生產建立實用化基礎的必要部分。

技術實現思路

[0011]技術挑戰
[0012]因此，本專利技術人為了高速/大規模生產中腦類器官，將使用96或384孔板等微孔板，不使用震蕩生物反應器(shaking bioreactor)，利用高速批量篩選(high throughput screening；HTS)平臺(platform)生產中腦類器官。這樣，除了在HTS平臺上生產中腦類器官(如圖3所示)外，HTS平臺上還可以實現個體間變異少、異常分化和死核受到抑制的正常水平中腦類器官的高速、大規模生產，在高速、大規模生產中腦類器官的情況下，與現有方法生產的中腦類器官相比，顯示出明顯提高的均勻性和功能性。進一步發現，可以節省生產中腦類器官所需的時間和費用。
[0013]因此，本專利技術的目的是提供三維細胞集合體的高速大規模培養方法，所述方法是從人類干細胞高速培養三維細胞集合體的方法，包括以下步驟：
[0014]從與人類分離的細胞形成胚狀體(Embryoid body)的步驟；
[0015]從所述胚狀體誘導分化為特定組織，形成三維細胞集合體的步驟；和
[0016]誘導所述三維細胞集合體成熟的步驟，
[0017]其特征在于，從形成所述胚狀體的步驟到誘導所述三維細胞集合體成熟的步驟，在同一個微孔板中連續地進行培養大規模。
[0018]本專利技術的另一個目的是提供由三維細胞集合體的高速大規模培養方法制造的三維細胞集合體。
[0019]本專利技術的另一個目的是提供三維細胞集合體培養套件，其包括三維細胞集合體的凹培養部；和包括覆蓋所述凹培養部的覆蓋部。
[0020]本專利技術的另一個目的是提供三維中腦細胞集合體，其是從人類胚胎干細胞、人類誘導多能干細胞和成體干細胞中的任何一種培養出來的三維中腦細胞集合體；
[0021]所述三維中腦細胞集合體是形成神經黑色素的三維中腦細胞集合體。
[0022]本專利技術的另一個目的是提供從人類干細胞到三維細胞集合體的高速培養方法，包括以下步驟：
[0023]從與人類分離的細胞形成胚狀體的步驟；
[0024]從所述胚狀體誘導分化為特定組織，形成三維細胞集合體的步驟；和
[0025]誘導所述三維細胞集合體成熟的步驟；
[0026]從形成所述胚狀體的步驟到誘導所述三維細胞集合體成熟的步驟，在同一個微孔板中連續非震蕩培養；
[0027]所述高速培養方法的特征在于，是以包括移液器機器人、自動搬運、平板運輸工具的自動化方式進行的三維細胞集合體的高速培養方法。
[0028]本專利技術的另一個目的是提供多巴胺能神經元相關疾病藥物的篩選方法，包括：
[0029]從多巴胺能神經元相關疾病患者來源的誘導多能干細胞生成三維細胞集合體的步驟；
[0030]用候選物質處理所述三維細胞集合體的步驟；
[0031]從所述三維細胞集合體中確定多巴胺能神經元存活率的步驟。
[0032]本專利技術的另一個目的是提供為治療多巴胺能神經元相關疾病提供信息的方法，包括以下步驟：
[0033]從多巴胺能神經元相關疾病患者來源的細胞培養三維細胞集合體的步驟；
[0034]用候選物質處理所述三維細胞集合體的步驟；
[0035]從所述三維細胞集合體中確定多巴胺能神經元存活率的步驟；
[0036]根據所述多巴胺能神經元存活率，為患者提供合適的治療藥物信息的步驟。
[0037]本專利技術的另一個目的是提供用于藥物測試的三維細胞集合本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.三維細胞集合體的高速大規模培養方法，所述方法是從人類干細胞高速培養三維細胞集合體的方法，包括以下步驟：從與人類分離的細胞形成胚狀體(Embryoid body)的步驟；從所述胚狀體誘導分化為特定組織，形成三維細胞集合體的步驟；和誘導所述三維細胞集合體成熟的步驟；其特征在于，從形成所述胚狀體的步驟到誘導所述三維細胞集合體成熟的步驟，在同一個微孔板中連續地進行培養。2.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，所述與人類分離的細胞為人類胚胎干細胞(human embryonic stem cell；hESC)、誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell)和成體干細胞中的其中一種。3.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，所述三維細胞集合體在20至50天內形成。4.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，在所述三維細胞集合體形成后，在進一步進行震蕩培養的情況下，可以長期培養。5.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，所述微孔板是具有凹部的多孔板。6.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，所述與人類分離的細胞的初始起始細胞數是50至3000個。7.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，所述高速大規模培養方法是在三維細胞集合體形成的整個過程中不使用生物反應器。8.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，所述三維細胞集合體是中腦細胞集合體。9.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，所述三維細胞集合體是從肝臟、心臟和肺組成的群中選擇的經過消化的器官制備。10.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，所述形成三維細胞集合體的步驟包括外胚層形成步驟或中腦組織分化步驟。11.根據權利要求10所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，所述外胚層形成步驟是在包括CHIR99021、二氫脫氧嗎啡和A83
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01(雙重SMAD抑制劑)的培養基中進行。12.根據權利要求10所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，所述中腦組織分化步驟是在包括CHIR99021、二氫脫氧嗎啡、A83
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01、IWP、SAG和FGF
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8b的培養基中進行。13.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，誘導所述三維細胞集合體成熟的步驟是在培養基中進行的，所述培養基包括SAG、FGF
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8b、胰島素(Insulin)、層粘連蛋白(Laminin)，并進一步包括抑制生長因子的基質膠。14.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，形成所述三維細胞集合體的步驟中，在組織分化誘導后7天內，沒有表達內胚層標記，表達外胚層形成因子。15.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，形成所述三維細胞集合體的步驟中，在組織分化誘導后14天內，沒有表達前腦或后腦標記，表達中腦標記。16.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法，誘導所述三維細胞集合體成熟的步驟中，表達中腦多巴胺能神經元的標記。
17.根據權利要求1所述的三維細胞集合體的高速大規模培養方法制造的三維細胞集合體。18.三維細胞集合體培養套件，其包括含有根據權利要求17所述的三維細胞集合體的凹培養部；和包括覆蓋所述凹培養部的覆蓋部。19.根據權利要求18所述的三維細胞集合體培養套件，其包括保存液。20.三維中腦細胞集合體，其是從人類胚胎干細胞、人類誘導多能干細胞和成體干細胞中的任何一種培養出來的三維中腦細胞集合體，所述三維中腦細胞集合體是形成神經黑色素的三維中腦細胞集合體。2...

【專利技術屬性】
技術研發人員：韓東旭，郭浩，姚雪瑞，金哲龍，金南衡，
申請(專利權)人：廣東省奧干諾伊德生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：