一種多巴胺能神經元的誘導分化方法及其應用技術

本發明專利技術公開了一種多巴胺能神經元的誘導分化方法及其應用。所述誘導分化方法包括：采用誘導試劑對所述干細胞進行誘導分化，從而獲得多巴胺能神經元；其中，所述誘導試劑包括生長因子及小分子化合物，所述小分子化合物包括SB431542、LDN193189、SAG、RA、cAMP、LAA中的任意兩種以上的組合。本發明專利技術將多巴胺能神經元誘導方法中的部分生長因子替換為小分子化合物，大大降低了成本，并且小分子化合物較生長因子穩定性好，保證了培養條件的一致性以及分化效率的穩定；同時本發明專利技術提供的誘導分化方法具有成本低、周期短、分化效果好的優點。分化效果好的優點。分化效果好的優點。

【技術實現步驟摘要】
一種多巴胺能神經元的誘導分化方法及其應用


[0001]本專利技術屬于神經生物學
，具體涉及一種多巴胺能神經元的誘導分化方法及其應用。

技術介紹

[0002]神經元是不可再生細胞。利用體細胞重編程獲得誘導多能干細胞(induced pluripotent stemcells，iPSCs)，并誘導分化為目標靶細胞，是生命科學領域的前沿技術，有很好的科學研究與臨床應用價值。將人源iPSCs誘導分化為神經元，使獲得大量高純度的人源性神經元變為可能。iPSCs技術在科學研究與臨床應用方面均有重要意義。在科學研究方面，人源iPSCs誘導分化的多巴胺能(DA)神經元，克服了傳統細胞系來源帕金森病(PD)模型的不足，更加真實地還原了PD患者腦內情況，使研究結果更加真實可靠。在臨床應用方面，iPSCs及分化的細胞顯示出對多種疾病具有臨床療效。iPSCs技術在疾病治療中的運用，率先在PD患者、視網膜黃斑變性患者和擴張性心肌病患者中開展。目前利用iPSCs技術治療PD已在日本展開臨床研究，將iPSCs來源多巴胺能祖細胞(DAP)移植入PD患者腦內，并進入臨床觀察階段。干細胞技術為難治性疾病帶來了治療的希望。而干細胞治療的臨床研究尚屬初期，仍存在多種不足，比如iPSCs誘導分化DA神經元周期長、成本高、分化效率不穩定等，是目前急需克服的技術問題。
[0003]目前多巴胺能神經元的分化方法，涉及眾多生長因子。由于生長因子價格昂貴、保存時間短，因此目前的分化方法費用較高，且對生長因子的儲存、穩定性，與生長批次要求很高，其活性下降也是造成分化效率不穩定的原因之一；而市場上商品化的DA神經元誘導試劑盒(比如：Gibco公司、Stem cell公司)價格昂貴，且同樣存在誘導周期長(2月)、分化效率不穩定等缺點，難以推廣運用于臨床。

技術實現思路

[0004]本專利技術的主要目的在于提供一種多巴胺能神經元的誘導分化方法及其應用，以克服現有技術的不足。
[0005]為實現前述專利技術目的，本專利技術采用的技術方案包括：
[0006]本專利技術實施例提供了一種多巴胺能神經元的誘導分化方法，其包括：
[0007]采用誘導試劑對干細胞進行誘導分化，從而獲得多巴胺能神經元；
[0008]其中，所述誘導試劑包括生長因子及小分子化合物，所述小分子化合物包括SB431542、LDN193189、SAG、RA、cAMP、LAA中的任意兩種以上的組合；所述生長因子包括BDNF、FGF8b、GDNF、TGF
?
β3的任意一種或兩種以上的組合。
[0009]在一些較為具體的實施方案中，采用包含誘導試劑的培養基對所述誘導多能干細胞進行誘導分化，其中所述培養基中還包括輔助試劑，所述輔助試劑包括laminin及Y
?
27632。
[0010]本專利技術實施例還提供了前述的多巴胺能神經元的誘導分化方法于制備治療帕金
森病的多巴胺能神經元的藥物中的用途。
[0011]與現有技術相比，本專利技術的有益效果在于：
[0012](1)本專利技術將現有多巴胺能神經元誘導方法中的部分生長因子替換為小分子化合物，大大降低了成本，并且小分子化合物較生長因子保質期長、穩定性好，保證了培養條件的一致性，以及分化效率的穩定；同時縮短了多巴胺能神經元的分化周期；
[0013](2)本專利技術提供的誘導分化方法具有成本低，周期短、分化效果好的優點。
附圖說明
[0014]為了更清楚地說明本專利技術實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本專利技術中記載的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0015]圖1A
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圖1C是本專利技術實施例1
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3中DA神經元的分化效果圖；
[0016]圖2A
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圖2B是本專利技術對比例1與實施例2神經元中的分化效果圖；
[0017]圖3A
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圖3B是本專利技術對比例2與實施例2神經元中的分化效果圖；
[0018]圖4A
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圖4B是本專利技術對比例3與實施例2神經元中的分化效果圖；
[0019]圖5A
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圖5B是本專利技術對比例4與實施例2神經元中的分化效果圖。
具體實施方式
[0020]鑒于現有技術的缺陷，本案專利技術人經長期研究和大量實踐，得以提出本專利技術的技術方案，本專利技術將傳統方法中部分生長因子替換為小分子化合物。小分子化合物價格較生長因子大大降低，且穩定性增高。以小分子化合物為主的誘導方法，將成本降低一半，且分化效率更穩定。申請人還對分化過程進行改進，使分化時間大大縮短。以E9細胞系為例，分化時間縮短為15
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17天，且分化效率高。此為目前文獻報道中最短的分化周期。下面將對本專利技術的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本專利技術一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本專利技術中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本專利技術保護的范圍。
[0021]具體的，作為本專利技術技術方案的一個方面，其所涉及的一種多巴胺能神經元的誘導分化方法包括：
[0022]采用誘導試劑對干細胞進行誘導分化，從而獲得多巴胺能神經元(記為“DA神經元”)；
[0023]其中，所述誘導試劑包括生長因子及小分子化合物，所述小分子化合物包括SB431542、LDN193189、SAG、RA、cAMP、LAA中的任意兩種以上的組合；所述生長因子包括BDNF、FGF8b、GDNF、TGF
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β3的任意一種或兩種以上的組合。
[0024]進一步地，所述RA用于神經干細胞的誘導，提高誘導效率與誘導速度。
[0025]在本專利技術中的誘導方案里，首次提出SMAD信號通路三重抑制的方法：在第一階段(SMAD信號通路雙重抑制)中加入第三種SMAD信號通路抑制劑RA，能夠使NSCs的誘導更完全，且有利于后續神經元亞型的誘導分化。不同腦區(前部、后部、背腹部等)神經元亞型的分化，取決于FGF8，SHH，RA等形態發生因子加入的時間點和作用天數。本專利技術中使用小分子
化合物SAG替代SHH。在雙重SMAD信號通路抑制劑(SB431542和LDN193189)聯合RA誘導NSCs后，撤掉SB431542，結束三重抑制劑的NSCs誘導進程，同時加入SAG，利用SAG聯合RA的方案誘導中腦區域神經元亞型。在SAG聯合RA作用5天后，撤掉RA并加入FGF8，利用SAG聯合FGF8方案誘導多巴胺能神經元。在這一階段，培養基中同時包含BDNF、L
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AA等神經營養因子和輔助因子。作用3天后，利用BDNF、GDNF、TGF
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β3、L
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AA、cAMP聯合作用，促進多巴胺能神經元的成熟。
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【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種多巴胺能神經元的誘導分化方法，其特征在于包括：采用誘導試劑對干細胞進行誘導分化，從而獲得多巴胺能神經元其中，所述誘導試劑包括生長因子及小分子化合物，所述小分子化合物包括SB431542、LDN193189、SAG、RA、cAMP、LAA中的任意兩種以上的組合；所述生長因子包括BDNF、FGF8b、GDNF、TGF
?
β3的任意一種或兩種以上的組合。2.根據權利要求1所述的誘導分化方法，其特征在于包括：采用包含誘導試劑的培養基對所述誘導多能干細胞進行誘導分化，其中所述培養基中還包括輔助試劑，所述輔助試劑包括laminin及Y
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27632；優選的，所述laminin及Y
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27632能夠抑制細胞凋亡、促進神經元貼壁；和/或，所述干細胞包括人類胚胎干細胞和/或誘導多能干細胞。3.根據權利要求2所述的誘導分化方法，其特征在于具體包括：(1)采用包含RA、LDN193189、SB431542的培養基對所述干細胞進行誘導分化3
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6天；(2)采用包含LDN193189、RA、SAG、laminin、Y
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27632的培養基對步驟(1)所獲產物進行誘導分化4
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5天；(3)采用包含BDNF、LAA、SAG、FGF8b、laminin、Y
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27632的培養基對步驟(2)所獲產物進行誘導分化3
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8天；(4)采用包含BDNF、GDNF、TGF
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β3、LAA、cAMP、laminin、Y
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27632的培養基對步驟(3)所獲產物進行誘導分化5
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12天，從而獲得所述多巴胺能神經元。4.根據權利要求2所述的誘導分化方法，其特征在于具體包括：(1)采用包含SB431542、LDN193189、RA的第一培養基對所述誘導多能干細胞于37℃進行第一階段誘導分化3
?
6天，獲得第一階段誘導分化產物；(2)采用包含LDN193189、RA、SAG、Y
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27632、laminin的第二培養基對所述第一階段誘導分化產物于37℃進行第二階段誘導分化2天，獲得第二階段誘導分化產物；(3)采用包含LDN193189、RA、SAG、Y
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27632、laminin的第三培養基對所述第二階段誘導分化產物于37℃進行第三階段誘導分化1
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2天，獲得第三階段誘導分化產物；(4)采用包含LDN193189、RA、SAG、Y
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27632、laminin的第四培養基對所述第三階段誘導分化產物于37℃進行第四階段誘導分化1天，獲得第四階段誘導分化產物；(5)采用包含BDNF、LAA、SAG、FGF8b、Y
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27632、laminin的第五培養基對所述第四階段誘導分化產物于37℃進行第五階段誘導分化1天，獲得第五階段誘導分化產物；(6)采用包含BDNF、LAA、SAG、FGF8b、Y
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27632、laminin的第六培養基對所述第五階段誘導分化產物于37℃進行第六階段誘導分化2
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7天，獲得第六階段誘導分化產物；(7)采用包含BDNF、GDNF、TGF
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β3、LAA、cAMP、Y
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27632、laminin的第七培養基對所述第六階段誘導分化產物于37℃進行第七階段誘導分化5
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12天，獲得所述多巴胺能神經元。5.根據權利要求4所述的誘導分化方法，其特征在于，所述第一培養基包括如下組分：杜氏改良Eagle培養基/營養混合物F
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12，谷氨酰胺衍生物1X，非必須氨基酸1X，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：程筱雨，劉春風，王芬，毛成潔，丁妹，王媚瑕，
申請(專利權)人：蘇州大學附屬第二醫院，
類型：發明
國別省市：