FLT3和CD3的抗體構建體制造技術

本公開涉及FLT3和CD3的抗體構建體，即雙特異性抗體構建體，其包含與靶細胞表面上的人FLT3結合的第一結合結構域和與T細胞表面上的人CD3結合的第二結合結構域。此外，本公開提供編碼抗體構建體的多核苷酸，包含所述多核苷酸的載體以及用所述多核苷酸或載體轉化或轉染的宿主細胞。此外，本公開提供了產生本公開的抗體構建體的方法，所述抗體構建體的醫(yī)學用途以及包含所述抗體構建體的試劑盒。以及包含所述抗體構建體的試劑盒。以及包含所述抗體構建體的試劑盒。

【技術實現步驟摘要】
FLT3和CD3的抗體構建體
[0001]本申請為一項專利技術專利申請的分案申請，其母案的申請日為2016年8月1日、申請?zhí)枮?01680044598.1、專利技術名稱為
″
FLT3和CD3的抗體構建體
″
。
[0002]本專利技術涉及雙特異性抗體構建體，其包含與靶細胞表面上的人FLT3結合的第一結合結構域和與T細胞表面上的人CD3結合的第二結合結構域。此外，本專利技術提供編碼抗體構建體的多核苷酸，包含所述多核苷酸的載體以及用所述多核苷酸或載體轉化或轉染的宿主細胞。此外，本專利技術提供了產生本專利技術的抗體構建體的方法，所述抗體構建體的醫(yī)學用途以及包含所述抗體構建體的試劑盒。
[0003]引言：
[0004]急性骨髓性白血病(AML)是異質性血液惡性腫瘤，其為成人中診斷的最常見類型的急性白血病。AML占所有白血病的約三分之一，僅在美國在2013年就報告了估計并且14,500例新病例，總體存活率差。過去三十年來，AML患者的護理標準幾乎沒有改善。然而，分子和細胞生物學的最新進展已徹底改變了我們對正常和患病狀態(tài)下人造血作用的理解。參與疾病發(fā)病機制的幾個主要參與者已被鑒定，并可作為可行的靶標來接受詢問。在約30％的AML中最常發(fā)生突變的一個這樣的激活“驅動”基因是FLT3。
[0005]Fms樣酪氨酸激酶3(FLT3)(也稱為胎肝激酶2(FLK
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2)、人干細胞激酶1(SCK
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1)或分化簇抗原(CD135))是在1990年代由兩個獨立團體克隆的造血受體酪氨酸激酶。位于人染色體13q12上的FLT3基因編碼與其它III類家族成員(包括干細胞因子受體(c
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KIT)、巨噬細胞集落刺激因子受體(FMS)和血小板衍生生長因子受體(PDGFR))共享同源性的III類受體酪氨酸激酶蛋白。
[0006]在與FLT3配體結合后，FLT3受體發(fā)生同源二聚化，由此使得能夠使近膜結構域中的特定酪氨酸殘基自磷酸化，以及通過PI3K/Akt、MAPK和STAT5途徑進行下游激活。因此，FLT3在控制正常造血細胞的增殖、存活和分化中起著至關重要的作用。
[0007]人FLT3在CD34+CD38
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造血干細胞(HSC)以及樹突前體細胞的亞組中表達。FLT3表達也可以在多能祖細胞如CD34+CD38+CD45RA
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CD123低常見的骨髓性祖細胞(CMP)、CD34+CD38+CD45RA+CD123低粒細胞單核祖細胞(GMP)和CD34+CD38+CD10+CD19
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常見的淋巴祖細胞(CLP)中被檢測到。有趣的是，CD34+CD38
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CD45RA
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CD123
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巨核細胞紅細胞祖細胞(MEP)中幾乎不存在FLT3表達。因此，FLT3表達主要限于早期骨髓性和淋巴樣祖細胞，在更成熟的單核細胞譜系細胞中有一些表達。FLT3的這種有限的表達模式與在大多數造血組織以及前列腺、腎、肺、結腸和心臟中表達的FLT3配體的表達模式明顯不同。這些不同的表達模式使得FLT3表達是確定FLT3信號傳導途徑的組織特異性的限速步驟。
[0008]AML中最常見的FLT3突變是FLT3內部串聯重復(FLT3
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ITD)，在20％至38％的細胞遺傳學正常的AML患者中發(fā)現該內部串聯重復。當近膜結構域編碼序列的一部分被復制并以頭部至尾部取向插入時，形成FLT3
?
ITD。在慢性淋巴樣白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤患者中未鑒定出FLT3突變，暗示著具有對AML的強疾病特異性。通常在所有FAB亞型中觀察到突變型FLT3激活，然而，其在具有者FAB M5(單核細胞白血病)的AML患者中顯著增加，而FAB亞型M2和M6(粒細胞或紅系白血病)顯著不太頻繁地與FLT3激活有關，與
FLT3的正常表達模式一致。
[0009]小百分比的AML患者(5
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7％)在FLT3酪氨酸激酶結構域(FLT3TKD)中存在單個氨基酸突變(最常見地在D835處或在一些情況下在T842或I836處)，而更少的患者(～1％)在FLT3近膜結構域中具有涉及殘基579、590、591和594的突變。具有FLT3
?
ITD突變型AML的患者具有以早期復發(fā)和差的存活率為特征的侵襲性疾病形式，而總體存活和無事件存活不受FLT3
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TKD突變的存在顯著影響。此外，具有同時發(fā)生的TET2或DNMT3A突變的FLT3
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ITD突變的AML患者與具有野生型TET2或DNMT3A的FLT3
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ITD突變型AML患者相比，具有不利的總體風險特征，這突出了AML的臨床和生物學異質性。
[0010]FLT3
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ITD和FLT3 TKD突變均誘導FLT3的配體非依賴性激活，導致Ras/MAPK途徑和PI3K/Akt途徑的下游激活。然而，與任一突變相關的下游信號傳導途徑主要不同在于FLT3
?
ITD優(yōu)先激活STAT5，從而導致增強的增殖潛能和DNA修復途徑的異常調節(jié)。
[0011]與FLT3突變狀態(tài)不相關，FLT3磷酸化在三分之二以上的AML患者中是明顯的，并且FLT3在＞80％的AML母細胞中表達，在所有AML患者中有約90％表達FLT3，使其成為在大樣本量中與疾病發(fā)病機制相關的有吸引力的治療靶標。
[0012]幾種小分子抑制劑已成為具有FLT3突變的AML患者的有吸引力的治療選擇。第一代FLT3酪氨酸激酶抑制劑(TKI)的特征在于選擇性、效力的缺乏以及不利的藥代動力學特性。為了解決這個問題，已開發(fā)了更新和更具選擇性的藥劑；然而，它們的功效受限于二次抗性的出現。
[0013]幾種早期的FLT3 TKI包括米哚妥林(PKC412)、來妥替尼(CEP
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701)、舒尼替尼(SUI1248)和索拉非尼(BAY 43
?
9006)等等。在復發(fā)性或難治性AML患者中，這些多激酶靶向劑在I期和II期的響應率受到限制，這大概是由于它們無法達到有效的FLT3抑制而無劑量限制性毒性。奎扎替尼(Quizartinib)(AC220)已被開發(fā)為對FLT3野生型和FLT3
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ITD具有高選擇性的第二代FLT3 TKI，并且已在年輕的患者組群中尤其在移植圍環(huán)境中顯示出益處。然而，在接受奎扎替尼的復發(fā)患者中鑒定的FLT3中的繼發(fā)性突變強調了對為AML患者開發(fā)更好的治療策略的需要，同時強調FLT3作為治療靶標的有效性。
[0014]已在具有新生、復發(fā)/難治或繼發(fā)性疾病的AML患者中測試了幾種靶向劑。腫瘤抑制基因的表觀遺傳沉默在AML疾病發(fā)病機制中起著重要作用，DNA甲基轉移酶(DNMT)抑制劑如阿扎胞苷和地西他濱已取得了一定的臨床成功。此外，最近在AML患者的亞組中對影響組蛋白翻譯后修飾(例如EZH2和ASXL1突變)或D本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種雙特異性抗體構建體，所述雙特異性抗體構建體包含與靶細胞表面上的人和獼猴FLT3結合的第一結合結構域和與T細胞表面上的人CD3結合的第二結合結構域，其中所述第一結合結構域與FLT3的表位結合，所述表位包含在如SEQ ID NO:801
?
804中所示的FLT3的細胞外區(qū)域內。2.根據權利要求1所述的抗體構建體，其中所述第一結合結構域與包含在人FLT3的區(qū)域內的FLT3的表位結合，所述區(qū)域具有如SEQ ID NO:814(簇1)或SEQ ID NO:816(簇3)中所示的序列。3.根據前述權利要求中任一項所述的抗體構建體，其中所述抗體構建體呈選自由(scFv)2、scFv
?
單結構域mAb、雙抗體組成的組的形式和這些形式的寡聚體。4.根據權利要求2或3所述的抗體構建體，其中所述第一結合結構域包含含有CDR
?
H1、CDR
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H2和CDR
?
H3的VH區(qū)和含有CDR
?
L1、CDR
?
L2和CDR
?
L3的VL區(qū)，所述CDR選自由以下各項組成的組：SEQ ID NO:151
?
156、SEQ ID NO:161
?
166、SEQ ID NO:171
?
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?
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?
796。5.根據權利要求4所述的抗體構建體，其中所述第一結合結構域包含選自由以下各項中所示的VH區(qū)組成的組的VH區(qū)：SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:267、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:327、SEQ ID NO:337、SEQ ID NO:347、SEQ ID NO:357、SEQ ID NO:367、SEQ ID NO:377、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:407、SEQ ID NO:417、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:437、SEQ ID NO:447、SEQ ID NO:457、SEQ ID NO:467、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:487、SEQ ID NO:497、SEQ ID NO:507、SEQ ID NO:517、SEQ ID NO:527、SEQ ID NO:537、SEQ ID NO:547、SEQ ID NO:557、SEQ ID NO:567、SEQ ID NO:577、SEQ ID NO:587、SEQ ID NO:597、SEQ ID NO:607、SEQ ID NO:617、SEQ ID NO:627、SEQ ID NO:637、SEQ ID NO:647、SEQ ID NO:657、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:677、
NO:439、SEQ ID NO:449和SEQ ID NO:459、SEQ ID NO:469、SEQ ID NO:479和SEQ ID NO:489、SEQ ID NO:499、SEQ ID NO:509、SEQ ID NO:519和SEQ ID NO:529、SEQ ID NO:539、SEQ ID NO:549和SEQ ID NO:559、SEQ ID NO:569、SEQ ID NO:579和SEQ ID NO:589、SEQ ID NO:599、SEQ ID NO:609、SEQ ID NO:619和SEQ ID NO:629、SEQ ID NO:639、SEQ ID NO:649和SEQ ID NO:659、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:679和SEQ ID NO:689、SEQ ID NO:699、SEQ ID NO:709、SEQ ID NO:719和SEQ ID NO:729、SEQ ID NO:739、SEQ ID NO:749和SEQ ID NO:759、SEQ ID NO:769、SEQ ID NO:779和SEQ ID NO:789以及SEQ ID NO:799；
●
具有選自由SEQ ID NO:1
?
9組成的組的氨基酸序列的肽接頭；
●
具有選自由以下各項組成的組的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:103
●
任選地具有選自由SEQ ID NO:1
?
9組成的組的氨基酸序列的肽接頭；
●
具有選自由SEQ ID NO:104
?
134組成的組的氨基酸序列的多肽；和
●
任選地His
?
標簽，諸如SEQ ID NO 10中所示的所述標簽；(c)從N末端開始按以下順序包含以下各項的多肽：
●
具有氨基酸序列QRFVTGHFGGLX1PANG(SEQ ID NO:135)的多肽，其中X1為Y或H；和
●
具有選自由以下各項組成的組的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:219和SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:249和SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:279和SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:309、SEQ ID NO:319和SEQ ID NO:329、SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:349和SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:369、SEQ ID NO:379和SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:419和SEQ ID NO:429、SEQ ID NO:439、SEQ ID NO:449和SEQ ID NO:459、SEQ ID NO:469、SEQ ID NO:479和SEQ ID NO:489、SEQ ID NO:499、SEQ ID NO:509、SEQ ID NO:519和SEQ ID NO:529、SEQ ID NO:539、SEQ ID NO:549和SEQ ID NO:559、SEQ ID NO:569、SEQ ID NO:579和SEQ ID NO:589、SEQ ID NO:599、SEQ ID NO:609、SEQ ID NO:619和SEQ ID NO:629、SEQ ID NO:639、SEQ ID NO:649和SEQ ID NO:659、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:679和SEQ ID NO:689、SEQ ID NO:699、SEQ ID NO:709、SEQ ID NO:719和SEQ ID NO:729、SEQ ID NO:739、SEQ ID NO:749和SEQ ID NO:759、SEQ ID NO:769、SEQ ID NO:779和SEQ ID NO:789和SEQ ID NO:799；
●
具有選自由SEQ ID NO:1
?
9組成的組的氨基酸序列的肽接頭；
●
具有選自由以下各項組成的組的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:103；
●
具有氨基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO:137)或QRFCTGHFGGLHPCNG(SEQ ID NO:139)的多肽；和
●
任選地His
?
標簽，諸如SEQ ID NO 10中所示的所述標簽；(d)從N末端開始按以下順序包含以下各項的多肽：
●
具有選自由以下各項組成的組的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:
80、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:101；
●
具有SEQ ID NO:8中所示的所述氨基酸序列的肽接頭；
●
具有選自由以下各項組成的組的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:308、SEQ ID NO:318、SEQ ID NO:328、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:358、SEQ ID NO:368、SEQ ID NO:378、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:408、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:428、SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:448、SEQ ID NO:458、SEQ ID NO:468、...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：T，
申請(專利權)人：安進研發(fā)慕尼黑股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：