CsLNG基因在調(diào)控黃瓜果實(shí)形狀中的應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及CsLNG基因在調(diào)控黃瓜果實(shí)形狀中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)提供的CsLNG基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明專利技術(shù)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，CsLNG基因喪失功能，會(huì)導(dǎo)致突變體植株的果實(shí)長(zhǎng)度顯著降低，果實(shí)橫莖顯著增加，果形指數(shù)顯著降低；同時(shí)種子的長(zhǎng)度降低、寬度增加。本發(fā)明專利技術(shù)首次證明了CsLNG基因參與調(diào)控黃瓜果實(shí)和種子的形狀。因此，CsLNG基因可在改良黃瓜品種中得到應(yīng)用，培育不同果形的黃瓜新品種，以滿足市場(chǎng)的需求。以滿足市場(chǎng)的需求。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
CsLNG基因在調(diào)控黃瓜果實(shí)形狀中的應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)涉及生物
，具體涉及黃瓜CsLNG基因在調(diào)控黃瓜果實(shí)形狀中的應(yīng)用。

技術(shù)介紹

[0002]黃瓜(Cucumis sativus L.)為葫蘆科甜瓜屬一年生草本植物，果實(shí)是其主要商品器官，在花后7～14天達(dá)到商品成熟，其果實(shí)大小和形狀嚴(yán)重影響黃瓜產(chǎn)量和外觀品質(zhì)。不同地域、不同用途(鮮食或加工)、不同消費(fèi)者對(duì)果實(shí)形狀的喜好差異等導(dǎo)致黃瓜育種對(duì)果形多樣性的需求。因此，挖掘黃瓜果實(shí)形狀基因，對(duì)于培育不同市場(chǎng)理想外觀品質(zhì)的黃瓜具有重要意義。
[0003]黃瓜果實(shí)大多呈長(zhǎng)圓形或圓柱形，有果實(shí)長(zhǎng)度(L)/直徑(D)決定(Che and Zhang,2019)。目前在黃瓜中，通過(guò)構(gòu)建遺傳圖譜和開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記等手段篩選到多個(gè)果實(shí)大小(fruit size)、果實(shí)重量(fruit weight)和果實(shí)形狀(fruit shape index)相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)，彼此之間有重復(fù)區(qū)域(Bo et al.,2015；Weng et al.,2015；Pan et al.,2020)。其中果實(shí)大小QTL位點(diǎn)FS1.2、FS2.1和FS2.2參與黃瓜橫向生長(zhǎng)；FS3.2和FS3.3調(diào)節(jié)果實(shí)伸長(zhǎng)；FS5.2對(duì)黃瓜的圓形果實(shí)形狀影響最大(Pan et al.,2017a)。FS1.2編碼了番茄SUN的同源基因CsSUM5
?
26
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27a，調(diào)控黃瓜果實(shí)的長(zhǎng)寬比(Pan et al.,2017b)。雖然已知10余個(gè)調(diào)控黃瓜果長(zhǎng)的QTL，但具體的候選基因及其調(diào)控機(jī)制大多尚未解析。前人利用反向生物學(xué)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MADS
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box家族轉(zhuǎn)錄因子CsFUL1的一個(gè)A等位基因，負(fù)調(diào)控果長(zhǎng)發(fā)育(Zhao et al.,2019)；SF1(Short Fruit 1)編碼一個(gè)RING
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type E3連接酶，通過(guò)泛素化并降解自身和ACS2(乙烯合成酶)，以嚴(yán)格控制乙烯合成，來(lái)控制乙烯劑量依賴性的細(xì)胞分裂和果實(shí)伸長(zhǎng)(Xin et al,2019)；SF2(Short Fruit 2)編碼組蛋白去乙?；?，其突變導(dǎo)致果實(shí)細(xì)胞分裂減少而造成果實(shí)變短(Zhang et al.,2019)；CsFnl7.1編碼一種胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白，特異調(diào)控瓜把長(zhǎng)度，影響果形(Xu et al.,2020)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0004]本專利技術(shù)的目的是提供CsLNG基因及其在調(diào)控黃瓜果形中的應(yīng)用。
[0005]第一方面，本專利技術(shù)請(qǐng)求保護(hù)CsLNG蛋白、或其編碼基因、或其抑制因子、或含有其編碼基因或抑制因子的生物材料在調(diào)控黃瓜果實(shí)形狀中的應(yīng)用。
[0006]在本專利技術(shù)提供的上述應(yīng)用中，通過(guò)抑制CsLNG蛋白的編碼基因的表達(dá)，以降低黃瓜果實(shí)的長(zhǎng)度并增加黃瓜果實(shí)的寬度。
[0007]在本專利技術(shù)提供的上述應(yīng)用中，所述CsLNG蛋白具有以下任意一種氨基酸序列：
[0008]1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或，
[0009]2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或插入獲得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
[0010]在本專利技術(shù)提供的上述應(yīng)用中，CsLNG蛋白的編碼基因具有以下任一種核苷酸序列：
[0011](1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或，
[0012](2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換、缺失或插入獲得的具有相同功能蛋白的編碼核苷酸序列；或，
[0013](3)在嚴(yán)格條件下可以與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列進(jìn)行雜交的核苷酸序列。
[0014]所述黃瓜CsLNG基因的全長(zhǎng)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015]SEQ ID NO.1：
[0016][0017][0018][0019][0019][0019]序列中加粗
ATG為起始密碼子，起始密碼子之前序列為5
’
UTR序列；加粗TAA為終止密碼子，終止密碼子之后的序列為3
’
UTR；()內(nèi)序列為外顯子；下劃線分別為選取的第一個(gè)和第二個(gè)19bp的靶點(diǎn)序列，下劃線后加粗字體AGG和CGG為PAM位點(diǎn)。
[0020]本專利技術(shù)從前期構(gòu)建的華南型黃瓜品種32X的EMS誘變體庫(kù)中篩選到一個(gè)球形果突變體材料qiu，利用32X和qiu作為母本進(jìn)行自交，構(gòu)建F2極端表型混池，利用MutMap分析發(fā)現(xiàn)CsLNG基因上一個(gè)堿基的變化(C
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T)，導(dǎo)致氨基酸翻譯提前終止，最終產(chǎn)生球形果的表型。本專利技術(shù)在此工作基礎(chǔ)上從華北型長(zhǎng)果形黃瓜材料XTMC中克隆得到黃瓜CsLNG基因。
[0021]第二方面，本專利技術(shù)請(qǐng)求保護(hù)，CsLNG蛋白、或其編碼基因、或其抑制因子、或含有其編碼基因或抑制因子的生物材料在選育果實(shí)為球型果的黃瓜中的應(yīng)用。
[0022]第三方面，本專利技術(shù)提供用于敲除核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示基因的sgRNA，所述sgRNA針對(duì)的靶點(diǎn)序列如SEQ ID NO.5所示或如SEQ ID NO.6所示。
[0023]更具體地，本專利技術(shù)所提供的sgRNA的核苷酸序列中包含如SEQ ID NO.7所示或如SEQ ID NO.8所示的序列。
[0024]根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，本專利技術(shù)還請(qǐng)求保護(hù)上述黃瓜CsLNG基因或上述sgRNA在降低黃瓜果實(shí)長(zhǎng)度、增加黃瓜果實(shí)橫莖、增加黃瓜果實(shí)果形指數(shù)中的應(yīng)用。
[0025]第四方面，本專利技術(shù)提供一種黃瓜球型果的制備方法，包括：
[0026](1)采用SEQ ID NO.9
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12的引物擴(kuò)增獲得敲除黃瓜CsLNG基因的sgRNA序列；
[0027](2)將獲得的sgRNA序列構(gòu)建CRISPR/Cas9載體，獲得重組質(zhì)粒PKSE402G
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CRISPR/Cas9
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CsLNG；使用重組質(zhì)粒PKSE402G
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CR ISPR/Cas9
?
CsLNG進(jìn)行農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105的轉(zhuǎn)化，獲得重組農(nóng)桿菌EHA10；
[0028](3)采用重組農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化黃瓜，獲得T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因黃瓜植株，收獲種子；
[0029](4)將步驟(3)中獲得的種子種植，并進(jìn)行基因型鑒定，鑒定為CsLNG基因大片段缺失的植株為突變體植株，收獲突變體植株的球型果。
[0030]本專利技術(shù)的有益效果在于：
[0031]本專利技術(shù)提供的CsLNG基因位于QTL FS2.1區(qū)間內(nèi)，通過(guò)本專利技術(shù)驗(yàn)證，CsLNG基因控制黃瓜果實(shí)橫向和縱向生長(zhǎng)，影響果實(shí)形狀；對(duì)于黃瓜果實(shí)形狀調(diào)控將具有直接的育種和生產(chǎn)指導(dǎo)價(jià)值。
[0032]相對(duì)于野生型，Cslng#1和Cslng#2敲除植株的黃瓜果實(shí)長(zhǎng)度降低和寬度降低，表明CsLNG基因調(diào)控黃瓜果實(shí)形狀和籽粒形狀。
附圖說(shuō)明
[0033]圖1為本專利技術(shù)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.CsLNG蛋白、或其編碼基因、或其抑制因子、或含有其編碼基因或抑制因子的生物材料在調(diào)控黃瓜果實(shí)形狀中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)編輯CsLNG蛋白的編碼基因，以降低黃瓜果實(shí)的長(zhǎng)度并增加黃瓜果實(shí)的寬度。3.根據(jù)權(quán)利要求1
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2任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述CsLNG蛋白具有以下任意一種氨基酸序列：1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或，2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或插入獲得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1
?
2任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，CsLNG蛋白的編碼基因具有以下任一種核苷酸序列：(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或，(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換、缺失或插入獲得的具有相同功能蛋白的編碼核苷酸序列；或，(3)在嚴(yán)格條件下可以與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列進(jìn)行雜交的核苷酸序列。5.CsLNG蛋白、或其編碼基因、或其抑制因子、或含有其編碼基因或抑制因子的生物材料在選育果實(shí)為球型果的黃瓜中的應(yīng)用。6.用于敲除核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA針對(duì)的靶點(diǎn)序列如SEQ ID ...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張小蘭，劉小鳳，閆立英，謝洋，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：