編碼NADH泛醌氧化還原酶4號亞基的核酸及其用途制造技術

本發明專利技術涉及基因工程技術領域，尤其涉及編碼NADH泛醌氧化還原酶4號亞基的核酸及其用途。本發明專利技術對ND4的編碼核酸序列進行了密碼子優化，實驗表明，采用本發明專利技術優化后序列制備獲得的藥物處理可以顯著改善ND4突變導致的病人細胞的線粒體功能紊亂病變。細胞的線粒體功能紊亂病變。

【技術實現步驟摘要】
編碼NADH泛醌氧化還原酶4號亞基的核酸及其用途


[0001]本專利技術涉及基因工程
，尤其涉及編碼NADH泛醌氧化還原酶4號 亞基的核酸及其用途。

技術介紹

[0002]ND4(NADH
?
ubiquinone oxidoreductase chain 4，NADH泛醌氧化還原酶4 號亞基)是線粒體complex I(1號復合體)的核心亞基，它與其他六個亞基共 同構成了complex I的疏水區段。Complex I在線粒體呼吸鏈中扮演重要角色， 它能夠氧化三羧酸循環和β
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氧化產生的NADH，還原泛醌，提供質子運輸的 動力，從而幫助質子跨過線粒體內膜。線粒體DNA11778位點突變由線粒體 DNA(mtDNA)第11778位核苷酸發生突變引起的，此突變使呼吸鏈上ND4基因 編碼的第340位氨基酸由精氨酸變為組氨酸。雖然它們均為堿性氨基酸，但這 一位置的精氨酸是高度保守的。由于突變可能降低電子流動效率影響酶的活 性從而減少視神經細胞ATP的產生，細胞逐漸凋亡，從而導致患者發生Leber 遺傳性視神經病變LHON。
[0003]Leber遺傳性視神經病變(LHON)是一種由線粒體基因組點突變引起的 母系遺傳性疾病，全球發病率為1/30000。LHON患者的特征為：一般20
?
30歲 發病，隨著病程發展，患者的雙側視力急劇下降，直至最終失明。主要病因 是由于患者視網膜神經節細胞(RGCs)死亡，而RGC細胞的死亡要歸因于患 者的線粒體基因突變。大多數與LHON相關的突變發生在complex I各亞基的編 碼基因內，其中超過一半的突變發生于ND4的G11778A位點上。該突變占中國 LHON患者的89.2％，且預后最差。
[0004]目前傳統的藥物對治療LHON患者作用有限，而AAV介導的基因治療在 針對這類單基因突變的遺傳疾病方面展現出巨大的潛力。但AAV介導的基因 治療的效果依賴于基因序列，野生型AAV基因序列在以往的治療中表現出的 療效仍存在提高空間。

技術實現思路

[0005]有鑒于此，本專利技術要解決的技術問題在于提供編碼NADH泛醌氧化還原 酶4號亞基(ND4)的核酸及其用途，以期提高ND4的表達水平，提高治療 效果。
[0006]本專利技術提供了編碼NADH泛醌氧化還原酶4號亞基的核酸，包括I)～III) 中至少一種：
[0007]I)、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；
[0008]II)、與如I)所示的核苷酸序列具有至少70％同源性的序列且編碼如SEQID NO:2所示氨基酸序列的蛋白的核酸；優選為具有至少80％同源性；更優選 為具有至少85％同源性；更優選為具有至少90％同源性；更優選為具有至少 95％同源性；更優選為具有至少96％同源性；更優選為具有至少97％同源性； 更優選為具有至少98％同源性；更優選為具有至少99％同源性。
[0009]III)、與I)或II)部分互補或完全互補的核酸。
[0010]本專利技術還提供了NADH泛醌氧化還原酶4號亞基的轉錄單元，其包括： 啟動子、本發
明所述的編碼NADH泛醌氧化還原酶4號亞基(ND4)的核酸 和終止子。
[0011]本專利技術所述轉錄單元的5
’
端至3
’
端依次包括：
[0012]啟動子、所述的編碼核酸、調控片段A和終止子；
[0013]或啟動子、所述的編碼核酸、調控片段A、調控片段B和終止子。
[0014]本專利技術中，所述調控片段A和調控片段B選自COX10 UTR、SV40信號 片段。
[0015]本專利技術所述的重組載體，其包括骨架載體和本專利技術所述的核酸。
[0016]本專利技術所述的重組載體為病毒載體；所述病毒載體選自DNA病毒載體、 逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體中至少一種； 其中，腺相關病毒載體的血清型為AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或 AAV9。本專利技術所述重組載體的骨架載體為pAAV2。
[0017]一些實施例中，所述重組載體包括順序連接的：AAV2 5
’
ITR、CMV增強 子、CMV啟動子、Chimeric intron、MTS片段、SEQ ID NO:1所示序列的核 酸片段、標簽片段、COX10 UTR、SV40信號片段、AAV2 3
’
ITR；
[0018]另一些實施例中，所述重組載體包括順序連接的：AAV2 5
’
ITR、CMV增 強子、CMV啟動子、Chimeric intron、MTS片段、SEQ ID NO:1所示序列的 核酸片段、標簽片段、COX10 UTR、AAV2 3
’
ITR；
[0019]另一些實施例中，所述重組載體包括順序連接的：AAV2 5
’
ITR、CMV增 強子、CMV啟動子、Chimeric intron、MTS片段、SEQ ID NO:1所示序列的 核酸片段、標簽片段、SV40信號片段、AAV2 3
’
ITR。
[0020]本專利技術所述的核酸、轉錄單元、所述的重組載體在制備防治線粒體功能 紊亂病變的藥物中的應用。本專利技術所述的防治包括預防和/或治療。本專利技術所 述防治線粒體功能紊亂病變為視神經病變；一些實施例中，所述視神經病變 為遺傳性視神經病變。一些具體實施例中，本專利技術提供了所述的核酸、轉錄 單元、所述的重組載體在制備防治Leber遺傳性視神經病變的藥物中的應用。
[0021]本專利技術還提供了一種藥物，其包括：本專利技術所述的核酸、轉錄單元或所 述的重組載體，還可以包括藥學上可接受的載體和賦形劑。
[0022]本專利技術所述的藥物中包括：所述重組載體、Lipofectamine 2000試劑和無 血清DMEM培養基。一些實施例中，所述重組載體的濃度為0.8μg/100μL～1.0 μg/100μL。
[0023]本專利技術還提供了一種藥物的遞送方法，其將本專利技術所述的藥物制劑注射 至眼部，優選地為玻璃體腔注射。
[0024]本專利技術還提供了一種防治治療Leber遺傳性視神經病變的方法，其為給予 本專利技術所述的藥物。所述給予的方式為玻璃體腔注射。
[0025]本專利技術對ND4的編碼核酸序列進行了密碼子優化，實驗表明，采用本發 明優化后序列制備獲得的藥物處理可以顯著改善ND4突變導致的病人細胞的 線粒體功能紊亂病變。用AAV2
?
CMV
?
ND4opt1藥物處理293細胞，優化后 ND4可以在該細胞系中高效表達，且表達效率高于未優化的ND4序列。同時， 病人細胞經AAV2
?
CMV
?
ND4opt1藥物處理后，恢復了在半乳糖培養基生長的 能力，產生ATP的能力得到了改善并接近野生型細胞，證明其線粒體功能紊 亂得到了修正。因此此AAV2
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【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.編碼NADH泛醌氧化還原酶4號亞基的核酸，包括I)～III)中至少一種：I)、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；II)、與如I)所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的序列且編碼如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白的核酸；III)、與I)或II)完全互補的核酸。2.NADH泛醌氧化還原酶4號亞基的轉錄單元，其包括：啟動子、權利要求1所述的核酸和終止子。3.根據權利要求2所述的轉錄單元，其特征在于，其5
’
端至3
’
端依次包括：啟動子、權利要求1所述的核酸、調控片段A和終止子；或啟動子、權利要求1所述的核酸、調控片段A、調控片段B和終止子。4.重組載體，其包括骨架載體和權利要求1所述的核酸。5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于，其為病毒載體；所述病毒載體選自DNA病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體中至少一種；其中，腺相關病毒載體的血清型為AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9。6.根據權利要求4或5所述的重組載體，其特征在于，其骨架載體為pAAV2。7.根據權利要求6所述的重組載體，其特征在于，其包括順序連接的：AAV2 5
’
ITR、CMV增強子、CMV啟動子、Chimeric intro...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李斌，肖溯，
申請(專利權)人：紐福斯蘇州生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：