雙功能蛋白質(zhì)和包含其的藥物組合物制造技術(shù)

雙功能蛋白質(zhì)和包含其的藥物組合物。本發(fā)明專利技術(shù)涉及包含生物活性蛋白和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)突變蛋白的雙功能蛋白質(zhì)，以及包含其的藥物組合物。本發(fā)明專利技術(shù)提供了通過(guò)將生物活性蛋白和FGF突變蛋白連接至免疫球蛋白的Fc區(qū)而制備的雙功能蛋白質(zhì)，其具有改善的藥理學(xué)效力、體內(nèi)持續(xù)時(shí)間和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明專利技術(shù)的雙功能蛋白質(zhì)表現(xiàn)出改善的藥理學(xué)效力、體內(nèi)持續(xù)時(shí)間和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，并且含有所述雙功能蛋白質(zhì)作為活性成分的藥物組合物可以有效地用作用于糖尿病、肥胖、血脂異常、代謝綜合征、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎或心血管疾病的治療劑。管疾病的治療劑。管疾病的治療劑。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
雙功能蛋白質(zhì)和包含其的藥物組合物
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01680062638.5、專利技術(shù)名稱為“雙功能蛋白質(zhì)和包含其的藥物組合物”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，該母案申請(qǐng)是2016年10月28日提交的PCT國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/KR2016/012300進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)。


[0002]本專利技術(shù)涉及包含生物活性蛋白和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)突變蛋白的雙功能蛋白質(zhì)，以及包含其的藥物組合物。

技術(shù)介紹

[0003]胰高血糖素樣肽
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1(GLP
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1)是由31個(gè)氨基酸組成的腸降血糖素激素，其由腸道中的L細(xì)胞在受到食物等刺激時(shí)分泌。其生物效應(yīng)通過(guò)經(jīng)由GLP
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1受體的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生，所述受體是在靶組織如胰腺的β細(xì)胞、腦等中表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體。血液中分泌的GLP
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1具有不到2分鐘的非常短的半衰期，這由酶二肽基肽酶
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4(DPP
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4)對(duì)N端氨基酸的切割導(dǎo)致的活性損失引起。由于GLP
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1基于血糖水平刺激胰腺中β細(xì)胞分泌胰島素，因此其對(duì)降低血糖有很強(qiáng)的作用而不誘導(dǎo)低血糖。此外，在多種動(dòng)物模型和人中，施用GLP
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1導(dǎo)致體重減輕，已知這是由于其對(duì)食欲抑制使得食物攝入減少引起的。GLP
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1誘導(dǎo)β
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細(xì)胞增殖并通過(guò)胰腺中β細(xì)胞中表達(dá)的GLP
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1受體抑制由糖脂毒性導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，從而增強(qiáng)β
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細(xì)胞的生存力。胰高血糖素過(guò)量分泌會(huì)增加血糖，這已知是糖尿病患者高血糖的原因之一。另外，已知GLP
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1作用于胰腺中的α
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細(xì)胞，通過(guò)抑制蛋白激酶A(PKA)蛋白特異性胰高血糖素的分泌來(lái)抑制空腹血糖升高。
[0004]毒蜥外泌肽
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4(Exendin
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4)是臨床上重要的GLP
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1受體激動(dòng)劑。毒蜥外泌肽
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4是具有39個(gè)氨基酸殘基的多肽，并且通常在Gila Monster蜥蜴的唾液腺中產(chǎn)生。已知毒蜥外泌肽
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4與GLP
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1具有52％的氨基酸序列同源性，并與哺乳動(dòng)物中的GLP
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1受體相互作用(Thorens等(1993)Diabetes 42：1678
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1682)。已顯示毒蜥外泌肽
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4體外刺激胰島素產(chǎn)生細(xì)胞分泌胰島素，并且在等摩爾條件下誘導(dǎo)的胰島素產(chǎn)生細(xì)胞的胰島素釋放強(qiáng)于GLP
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1。雖然毒蜥外泌肽
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4強(qiáng)烈刺激胰島素分泌以降低嚙齒類動(dòng)物和人二者的血糖水平且作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)于GLP
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1，但毒蜥外泌肽
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4在沒(méi)有GLP
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1的哺乳動(dòng)物中表現(xiàn)出抗原性，因?yàn)槠渚哂羞@樣的動(dòng)物中不熟悉的表位。
[0005]已在臨床上證實(shí)了GLP
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1和毒蜥外泌肽
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4類似物(例如利拉魯肽和百泌達(dá)(byetta))改善人中葡萄糖控制的能力。已報(bào)道了GLP
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1通過(guò)抑制凋亡和誘導(dǎo)增殖來(lái)增加β細(xì)胞群。此外，還報(bào)道了GLP
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1作為抑制胃酸分泌和胃排空的腸激素起作用，同時(shí)增強(qiáng)飽腹感信號(hào)，從而降低食欲。GLP
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1的這些作用可以解釋當(dāng)向患有2型糖尿病的患者施用GLP
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1類似物時(shí)觀察到的體重減輕。另外，GLP
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1在嚙齒類動(dòng)物缺血后表現(xiàn)出心臟保護(hù)作用。
[0006]已經(jīng)進(jìn)行了多種嘗試來(lái)開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效GLP
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1類似物。臨床證實(shí)的長(zhǎng)效GLP
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1類似物包括度拉糖肽(dulaglutide)(WO 2005/000892)和阿必魯肽(albiglutide)(WO 2003/059934)。度拉糖肽是一種Fc融合的GLP
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1類似物，阿必魯肽是一種白蛋白融合的GLP
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1類似物，這二
者的藥代動(dòng)力學(xué)譜允許每周施用一次。這兩種藥物每周施用一次具有降低血糖和減輕體重的優(yōu)異作用，并且與百泌達(dá)和利拉魯肽相比，這兩種藥物在治療方面還提供了極大改進(jìn)的便利。
[0007]同時(shí)，在肝中合成的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)是已知在葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用的激素。FGF21在表達(dá)FGF21特異性受體(即FGF受體)和β
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klotho復(fù)合物二者的肝、脂肪細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、腦中的下丘腦和肌肉組織中展示藥理學(xué)作用。已經(jīng)報(bào)道，在多種糖尿病和代謝疾病的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和鼠模型中，F(xiàn)GF21可以以胰島素非依賴性方式降低血糖水平，減輕體重，和降低血液中的甘油三酯和低密度脂蛋白(low
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density lipoprotein，LDL)濃度。此外，由于其改善胰島素敏感性的作用，F(xiàn)GF21具有開(kāi)發(fā)作為糖尿病和肥胖的新治療劑的潛力(參見(jiàn)WO2003/011213)。
[0008]因此，為了開(kāi)發(fā)基于FGF21的新抗糖尿病藥，已經(jīng)嘗試了通過(guò)基于野生型FGF21序列通過(guò)替換、插入和缺失一些氨基酸構(gòu)建FGF21突變體來(lái)提高其生物學(xué)活性和體內(nèi)穩(wěn)定性(參見(jiàn)WO2010/065439)。然而，由于FGF21具有非常短的半衰期，已經(jīng)證明如果直接用作生物治療劑，其是有問(wèn)題的(Kharitonenkov，A.等(2005)Journal of Clinical Investigation 115：1627
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1635)。在小鼠中，F(xiàn)GF21的體內(nèi)半衰期為1至2小時(shí)，并且在猴中為2.5至3小時(shí)。因此，對(duì)于FGF21以其當(dāng)前形式用作糖尿病的治療劑，需要每日施用。
[0009]已經(jīng)報(bào)道了嘗試提高FGF21重組蛋白的體內(nèi)半衰期的多種方法。一個(gè)這樣的實(shí)例是將聚乙二醇(PEG)(即聚合物材料)與FGF21連接以增加其分子量，由此抑制腎排泄并提高體內(nèi)保留時(shí)間(參見(jiàn)WO2012/066075)。另一種方法嘗試通過(guò)將其與結(jié)合至人白蛋白的脂肪酸融合來(lái)提高半衰期(參見(jiàn)WO2012/010553)。另一個(gè)實(shí)例嘗試通過(guò)產(chǎn)生激動(dòng)劑抗體來(lái)在維持與在野生型FGF21等同的藥理學(xué)活性的同時(shí)提高半衰期，所述激動(dòng)劑抗體與單獨(dú)或作為與β
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klotho復(fù)合物的人FGF受體特異性結(jié)合(參見(jiàn)WO2012/170438)。在另一個(gè)實(shí)例中，通過(guò)制備長(zhǎng)效融合蛋白來(lái)提高半衰期，在所述長(zhǎng)效融合蛋白中IgG的Fc區(qū)與FGF21分子結(jié)合(參見(jiàn)WO2013/188181)。
[0010]在可用于產(chǎn)生長(zhǎng)效藥物的各種技術(shù)中，廣泛使用了Fc融合技術(shù)，因?yàn)槠渚哂休^少的利用其他方法時(shí)見(jiàn)到的缺點(diǎn)，例如在提高體內(nèi)半衰期的同時(shí)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或毒性。為了開(kāi)發(fā)作為長(zhǎng)效治療藥物的Fc融合FGF21蛋白，應(yīng)滿足以下條件。
[0011]首先，應(yīng)最小化由融合引起的體外活性降低。FGF2本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.雙功能蛋白質(zhì)，其包含：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)突變蛋白；生物活性蛋白或其突變體或片段；和免疫球蛋白的Fc區(qū)，其中所述FGF21突變蛋白包含選自以下突變(1)至(7)的至少一種突變：(1)從野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替換為氨基酸序列EIRP(SEQ ID NO：68)；(2)從野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替換為氨基酸序列TGLEAV(SEQ ID NO：69)；(3)從野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替換為氨基酸序列TGLEAN(SEQ ID NO：70)；(4)從野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替換為氨基酸N；(5)從野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替換為氨基酸N；(6)從野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替換為氨基酸E，以及上述突變(1)至(5)的一種或更多種；和(7)用于降低野生型FGF21蛋白之免疫原性的1至10個(gè)氨基酸的突變。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙功能蛋白質(zhì)，其中通過(guò)突變引入的所述FGF21突變蛋白的氨基酸殘基N是糖基化的。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙功能蛋白質(zhì)，其中所述生物活性蛋白選自胰島素、C肽、瘦蛋白、胰高血糖素、胃泌素、胃抑制性多肽(GIP)、胰淀素、降鈣素、膽囊收縮素、肽YY、神經(jīng)肽Y、骨形態(tài)發(fā)生蛋白
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6(BMP
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6)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白
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9(BMP
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9)、胃泌酸調(diào)節(jié)素、催產(chǎn)素、胰高血糖素樣肽
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1(GLP
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1)、胰高血糖素樣肽
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2(GLP
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2)、鳶尾素、含纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域蛋白5(FNDC5)、愛(ài)帕琳肽、脂聯(lián)蛋白、C1q和腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白(CTRP家族)、抵抗素、內(nèi)脂素、網(wǎng)膜蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白
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4(RBP
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4)、腸高血糖素、血管生成素、白介素22(IL
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22)、毒蜥外泌肽
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4和生長(zhǎng)激素。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙功能蛋白質(zhì)，其中所述生物活性蛋白選自GLP
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1、其突變體和毒蜥外泌肽
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4。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙功能蛋白質(zhì)，其中所述GLP
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1的突變體具有由SEQ ID NO：43至46中任一個(gè)表示的氨基酸序列。6.根據(jù)權(quán)利要求1...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：金埈煥，林世榮，徐旼志，崔鉉浩，金度勛，朱美敬，樸珠英，金瑟吉，林尚勉，金鍾均，南受延，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：株式會(huì)社柳韓洋行，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：