本發明專利技術涉及醫藥生物領域，具體涉及人乳頭瘤病毒HPV59型L1蛋白的表達和類病毒樣顆粒及其制備方法。對HPV59型L1蛋白的氨基酸序列進行截短，并針對該截短后的蛋白的編碼核苷酸序列進行密碼子優化得到優化的編碼核苷酸序列，最后配合含有特定SD序列無標簽表達載體實現無標簽表達純化。本發明專利技術通過上述改進使得在原核表達系統例如大腸桿菌表達系統中可以獲得更高的蛋白表達量，且得到質量更均一的VLP。且得到質量更均一的VLP。
【技術實現步驟摘要】
人乳頭瘤病毒HPV59 L1蛋白的表達和類病毒樣顆粒及其制備方法
[0001]本專利技術涉及醫藥生物領域，具體涉及人乳頭瘤病毒HPV59 L1蛋白VLP（類病毒樣顆粒）的構建及表達。
技術介紹
[0002]人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一種無包膜的閉環雙鏈DNA病毒，屬乳多空病毒科多瘤病毒亞科，主要侵犯人體的上皮黏膜組織，進而誘發各種良性及惡性增生病變。目前已鑒定出來的不同亞型HPV超過200種，HPV感染具有明顯的組織特異性，不同型別的HPV對于皮膚和黏膜的嗜向性不同，能誘發不同的乳頭狀病變，大約有30多種HPV型別與生殖道感染有關，其中有20多種與腫瘤相關。
[0003]根據HPV誘發病變的良惡性不同，HPV可大致分為兩類：1）高危型（如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV59、HPV59、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV59等）：高危型HPV與人類多種組織惡性腫瘤密切相關，主要引起重度不典型增生和浸潤癌；2）低危型（如HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV72、HPV81等）：低危型HPV可引起表皮細胞良性增殖性性病，如尖銳濕疣和扁平濕疣等。HPV主要由病毒外殼和基因組DNA構成。基因組長約7900bp，有8個病毒蛋白編碼基因。其中6個ORF編碼的蛋白在病毒復制的早期表達，稱為早期蛋白；2個ORF編碼的蛋白在病毒復制的晚期表達，稱為晚期蛋白。晚期蛋白包括主要外殼蛋白L1及次要外殼蛋白L2，并參與病毒外殼的形成。HPV病毒外殼蛋白能夠進行自組裝，目前在專利文獻中，多采用酵母表達系統或者昆蟲表達系統或者在哺乳動物細胞表達系統里面單獨表達的L1蛋白或將L1 蛋白與L2蛋白共表達時均能自組裝成病毒樣顆粒（virus
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like particle ,VLP），利用外源表達體系生產的VLP免疫后能夠在體內誘發產生中和抗體，獲得良好的免疫保護效果。但是利用真核表達系統在體內直接表達組裝VLP，產生VLP的性質并不是很均一，并且真核表達系統的成本很高，不利于產業化。
[0004]目前針對HPV59型在CN202110442661.X中報道，采用的是漢遜酵母表達系統產生HPV59L1蛋白，漢遜酵母表達系統是真核表達系統，在體內直接組裝成VLP，該專利中并沒有提出是否在大腸桿菌原核表達系統里是否可以正常表達合格標準的蛋白，因為大腸桿菌原核表達系統并不具備漢遜酵母表達系統翻譯后修飾等功能，所以在原核表達系統里表達HPV59 L1是有一定難度的。因此，需要研究解決在原核表達系統里面表達HPV59L1蛋白困難的問題，以獲得更均一的VLP以及在產業應用上有更低的成本。
技術實現思路
[0005]本專利技術人針對基于疫苗成品成本的考慮，在原核表達系統里面表達HPV59 L1 蛋白，并解決了在原核表達系統里面表達HPV59L1蛋白困難的問題。具體通過以下改進實現：對HPV59型L1蛋白的氨基酸序列進行截短，并針對該截短后的蛋白的編碼核苷酸序列進行密碼子優化得到優化的編碼核苷酸序列，最后配合含有特定SD序列的無標簽表達載體實現
高效表達和純化。
[0006]首先，本專利技術將HPV59L1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)做N/C端截短處理，為了獲得更好的蛋白表達率。N端截短4個氨基酸，且在其C端截短31個氨基酸，具體的截短后的氨基酸見SEQ ID NO：2。N/C端截短處理后，可在無標簽表達載體上表達并且獲得更高質量的蛋白及VLP。
[0007]其中，SEQ ID NO :2所示序列如下：1
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MSSDNKVYLP PPSVAKVVST DEYVTRTSIF YHAGSSRLLT VGHPYFKVPK51
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GGNGRQDVPK VSAYQYRVFR VKLPDPNKFG LPDNTVYDPN SQRLVWACVG101
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QLCIIGCVPA IGEHWTKGTA CKPTTVVQGD CPPLELINTP IEDGDMVDTG201
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VFARHFWNRS GTMGDQLPES LYIKGTDIRA NPGSYLYSPS PSGSVVTSDS301
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QLFNKPYWLH KAQGLNNGIC WHNQLFLTVV DTTRSTNLSV CASTTSSIPN351
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FGVTPPPTAS LVDTYRFVQS AAVTCQKDTA PPVKQDPYDK LKFWPVDLKE451
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RFSADLDQFP LGRKFLLQLG ARP其次，為了利用大腸桿菌系統高效的表達HPV59L1蛋白，專利技術人根據SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，針對大腸桿菌系統進行核苷酸序列的密碼子優化。優化原則包括：a）按照大腸桿菌遺傳密碼使用頻率表選用使用頻率最高或較高的密碼子；b）消除常用的限制性內切酶識別位點。通過上述原則經過優化的核苷酸序列并進行多次篩選，獲得了優化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，進一步提供含有所述編碼核酸的表達盒，表達載體和重組宿主細胞。優選地，其是大腸桿菌。
[0008]其中，SEQ ID NO :3所示序列如下：1
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ATGTCTTCTG ACAACAAAGT TTACCTGCCG CCGCCGTCTG TTGCTAAAGT51
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TGTTTCTACC GACGAATACG TTACCCGTAC CTCTATCTTC TACCACGCTG101
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GTTCTTCTCG TCTGCTGACC GTTGGTCACC CGTACTTCAA AGTTCCGAAA151
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GGTGGTAACG GTCGTCAGGA CGTTCCGAAA GTTTCTGCTT ACCAGTACCG201
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TGTTTTCCGT GTTAAACTGC CGGACCCGAA CAAATTCGGT CTGCCGGACA251
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ACACCGTTTA CGACCCGAAC TCTCAGCGTC TGGTTTGGGC TTGCGTTGGT301
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【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種截短的HPV59型L1蛋白，其是在野生型HPV59型L1蛋白的基礎上，在其N端截短4個氨基酸，且在其C端截短31個氨基酸；優選地，截短的HPV59型L1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.編碼如權利要求1所述的截短的HPV59型L1蛋白的核酸；優選地，其經過密碼子優化的核酸；更優選地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.含有SD序列和編碼如權利要求2所述的截短的HPV59型L1蛋白的核苷酸序列的核酸，優選地，所述SD序列的核苷酸序列為5`
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3`。4.含有如權利要求2或3所述的編碼核酸的表達盒或表達載體。5.如權利要求4所述的表達盒或表達載體，其特征在于，其是原核表達載體，更優選地是在載體pGEX基礎上去除了GST標簽序列，并且整合所述SD序列的截短的HPV59型L1蛋白的核酸分子而得到。6.含有如權利要求2或3所述的編碼核酸的表達盒或表達載體的重組宿主細胞。7.如權利要求6所述的重組宿主細胞，其特征在于，其是原核細胞，優選為大腸桿菌。8.一種表達如權利要求1截短的HPV59型L1蛋白的方法，其特征在于，培養如權利要求6或7所述的重組宿主細胞以產生HPV59型L1蛋白，任選地，包括純化步驟，優選地所述純化步驟為：取所述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳曉，高文雙，薛俊蓮，劉永江，張海江，張瑞霞，陳丹，伍樹明，沈邇萃，張堯，銀飛，王學紅，
申請(專利權)人：北京康樂衛士生物技術股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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