基于納米金的適配體比色傳感檢測(cè)馬拉硫磷的方法及試劑盒技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供基于納米金的適配體比色傳感檢測(cè)馬拉硫磷的方法及試劑盒，屬于農(nóng)特檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，所述方法是向納米金溶液中加入馬拉硫磷適配體溶液，然后加入待測(cè)樣品溶液，最后加入氯化鈉溶液，觀察溶液顏色變化即可。基于此方法還發(fā)明專利技術(shù)了一種包含黑色背景板、三面透明一面為白色的特制連排比色皿，并配備有紅色到藍(lán)色的漸變標(biāo)準(zhǔn)比色卡的試劑盒，通過(guò)溶液顏色變化可實(shí)現(xiàn)馬拉硫磷的半定量檢測(cè)，本發(fā)明專利技術(shù)方法簡(jiǎn)單、快速、現(xiàn)象直觀，降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)的效率，可應(yīng)用于馬拉硫磷的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)分析。析。析。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
基于納米金的適配體比色傳感檢測(cè)馬拉硫磷的方法及試劑盒


[0001]本專利技術(shù)屬于農(nóng)藥檢測(cè)
，具體涉及一種馬拉硫磷的納米金適配體比色傳感檢測(cè)方法及試劑盒。

技術(shù)介紹

[0002]馬拉硫磷是高效低毒殺蟲(chóng)、殺螨劑，防治范圍廣。不僅用于稻、麥、棉，而且因毒性低、殘效短，也用于蔬菜、果樹(shù)、茶葉以及倉(cāng)庫(kù)的防蟲(chóng)。馬拉硫磷毒性較低，但是長(zhǎng)期不合理的使用會(huì)導(dǎo)致食品及生態(tài)環(huán)境中馬拉硫磷殘留量超標(biāo)，經(jīng)食物鏈的富集進(jìn)入人體內(nèi)，通過(guò)抑制體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性，造成人和動(dòng)物的肝臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損，嚴(yán)重的可導(dǎo)致中毒死亡。長(zhǎng)時(shí)間暴露于含馬拉硫磷的環(huán)境中也可能引發(fā)多種并發(fā)癥。
[0003]目前檢測(cè)馬拉硫磷的方法有液相色譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法和毛細(xì)管電泳法、基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法等，這些方法可以獲得準(zhǔn)確和靈敏的結(jié)果，但是需要繁瑣的樣品預(yù)處理和專業(yè)的人員。此外，昂貴復(fù)雜的儀器也限制了這些方法在快速檢測(cè)中的應(yīng)用。金納米粒子（AuNPs）具有特殊的光學(xué)特性，在最大吸收波長(zhǎng)處具有局部表面等離子體共振（LSPR）效應(yīng)，因此在電解質(zhì)溶液（高濃度NaCl）中能引起相應(yīng)顏色變化，顏色的變化程度與添加靶標(biāo)的濃度呈正相關(guān)。通過(guò)表征AuNPs體系顏色變化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)馬拉硫磷的快速半定量檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本專利技術(shù)的目的一在于提供基于納米金的適配體比色傳感檢測(cè)馬拉硫磷的方法，目的二在于提供一種試劑盒，目的三在于提供所述試劑盒在馬拉硫磷檢測(cè)中的應(yīng)用。本專利技術(shù)方法操作簡(jiǎn)便，向納米金溶液中加入馬拉硫磷適配體溶液，然后加入待測(cè)樣品溶液，最后加入氯化鈉溶液，通過(guò)溶液顏色變化可實(shí)現(xiàn)馬拉硫磷的半定量檢測(cè)，同時(shí)也可根據(jù)吸光度比值進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè)。基于該方法的試劑盒可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查馬拉硫磷，檢測(cè)結(jié)果靈敏度高、檢測(cè)限低，并且現(xiàn)象直觀，降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)的效率，具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用的具體方案為：第一方面，基于納米金的適配體比色傳感檢測(cè)馬拉硫磷的方法，包括如下步驟：（1）向納米金溶液中加入馬拉硫磷適配體溶液，進(jìn)行孵育，然后分別加入不同濃度的馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行孵育，最后加入氯化鈉溶液進(jìn)行孵育，觀察溶液顏色變化；用紫外分光光度計(jì)測(cè)定518nm和620nm處兩個(gè)紫外吸收峰處的吸光度，以馬拉硫磷濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的紫外吸收峰吸光度比值A(chǔ)
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為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述馬拉硫磷適配體序列如SEQ ID NO：01所示；所述馬拉硫磷適配體溶液的濃度為1~5μmol/L，所述馬拉硫磷適配體溶液與納米金溶液的孵育時(shí)間為8~12min；所述氯化鈉溶液的濃度為500~1000mmol/L；（2）將待測(cè)的樣品粉碎，用Tris
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HCl緩沖溶液與其混合，然后離心取上清液，再使
用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾上清液，得待檢樣品溶液；（3）按照步驟（1）的方式，將馬拉硫磷溶液替換為待檢樣品溶液，觀察溶液顏色的變化，得到待測(cè)樣品的半定量檢測(cè)結(jié)果；（4）測(cè)定并計(jì)算待檢樣品溶液的A
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值，根據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可對(duì)待檢樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè)。
[0006]步驟（1）中，納米金溶液中，金納米粒子的粒徑為10 nm，金納米粒子的濃度為8.1
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?9M（mol/L）。所述金納米粒子可以采用現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的各種方法進(jìn)行制備，只要粒徑符合要求即可。
[0007]在本專利技術(shù)的某一具體實(shí)施方式中，公開(kāi)了一種納米金溶液的制備方法，制備過(guò)程如下：在攪拌下將1 mL 1%的HAuCl4和79 mL超純水加入到一個(gè)燒瓶中，然后在攪拌下將4 mL濃度為1%的檸檬酸鈉、0.1 mL濃度為1%的單寧酸、0.1 mL濃度為25 mM的K2CO3和15.8 mL超純水加入到另一個(gè)燒瓶中，將上述兩種制備的溶液分別加熱至60 ℃并保持30 min，然后在高速攪拌下混合在一起，直至顏色變?yōu)榫萍t色且不再變化，然后冷卻至室溫，將溶液儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中，得到金納米粒子的水溶液。該方法所得的金納米粒子的粒徑為10 nm。
[0008]步驟（1）中，添加的馬拉硫磷適配體溶液的濃度為1μmol/L。
[0009]步驟（1）中，加入氯化鈉的濃度為500 mmol/L。
[0010]步驟（1）中，每次孵育時(shí)，均在室溫下孵育10 min。
[0011]步驟（3）中，將待測(cè)的樣品粉碎，取5.0 g樣本并加工成均質(zhì)的勻漿，加入20 mL濃度為10 mM的Tris
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HCl緩沖溶液與其混合，然后置于振蕩器上劇烈振蕩10 min，之后室溫下8000 r/min離心20 min，以除去固體物質(zhì)；然后使用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾上清液，將過(guò)濾后的上清液作為待測(cè)液。
[0012]步驟（3）中，當(dāng)觀察到溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，則表示樣品中含有馬拉硫磷。
[0013]第二方面，一種檢測(cè)馬拉硫磷的試劑盒，包含試劑1、試劑2、試劑3和試劑4，所述試劑1為納米金溶液，所述試劑2為馬拉硫磷適配體溶液，所述試劑3為氯化鈉溶液，所述試劑4為Tris
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HCl緩沖溶液；所述納米金溶液中金納米粒子的粒徑為10 nm，濃度為8.1
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?9mol/L；所述馬拉硫磷適配體序列如SEQ ID NO：01所示；所述馬拉硫磷適配體溶液的濃度為1~5μmol/L，所述氯化鈉溶液的濃度為500~1000mmol/L；優(yōu)選地，所述試劑盒還包含連排比色皿、用于觀察結(jié)果的黑色背景板、比色卡和0.22 μm的微孔濾膜；所述連排比色皿是將多個(gè)比色皿排列連接而成，所述連排比色皿的其中一個(gè)側(cè)面為白色，其余側(cè)面均透明。
[0014]第三方面，上述試劑盒在馬拉硫磷檢測(cè)方面的應(yīng)用。
[0015]本專利技術(shù)方法的原理為：馬拉硫磷適配體作為單鏈寡核苷酸分子，能夠通過(guò)靜電吸附作用與金納米粒子高效結(jié)合，加入NaCl溶液后，可以保護(hù)AuNPs不發(fā)生聚集，溶液顏色不發(fā)生變化，為紅色。當(dāng)待測(cè)物中存在靶標(biāo)時(shí)，適配體優(yōu)先與靶標(biāo)結(jié)合，適配體脫離AuNPs，加NaCl后導(dǎo)致AuNPs聚集，發(fā)生明顯的表面等離子體共振偏移，溶液顏色由紅色變成藍(lán)色；當(dāng)待測(cè)物中沒(méi)有靶標(biāo)時(shí)，適配體吸附在AuNPs上，加NaCl后不發(fā)生聚集，為紅色。在檢測(cè)過(guò)程
中，當(dāng)樣品中含有馬拉硫磷時(shí)，肉眼可以看出這一過(guò)程中溶液顏色的變化，通過(guò)此體系的顏色變化可以直觀可視化的實(shí)現(xiàn)半定量檢測(cè)，此外通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量檢測(cè)。本專利技術(shù)方法具有一定的可推廣性，對(duì)于其他的有機(jī)磷農(nóng)藥，可以采用相同的思路替換成相應(yīng)的適配體進(jìn)行檢測(cè)。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下有益效果：1. 本專利技術(shù)提供一種檢測(cè)馬拉硫磷的試劑盒，包含4種檢測(cè)試劑，試劑1：納米金溶液；試劑2：適配體溶液；試劑3：氯化鈉溶液；試劑4：Tris
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HCl緩沖溶液。以及0.22 μm微孔濾膜，此外本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.基于納米金的適配體比色傳感檢測(cè)馬拉硫磷的方法，其特征在于：包括如下步驟：（1）向納米金溶液中加入馬拉硫磷適配體溶液，進(jìn)行孵育，然后分別加入不同濃度的馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行孵育，最后加入氯化鈉溶液進(jìn)行孵育，觀察溶液顏色變化；用紫外分光光度計(jì)測(cè)定518nm和620nm處兩個(gè)紫外吸收峰處的吸光度，以馬拉硫磷濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的紫外吸收峰吸光度比值A(chǔ)
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為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述馬拉硫磷適配體序列如SEQ ID NO：01所示；所述馬拉硫磷適配體溶液的濃度為1~5μmol/L，所述馬拉硫磷適配體溶液與納米金溶液的孵育時(shí)間為8~12min；所述氯化鈉溶液的濃度為500~1000mmol/L；（2）將待測(cè)的樣品粉碎，用Tris
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HCl緩沖溶液與其混合，然后離心取上清液，再使用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾上清液，得待檢樣品溶液；（3）按照步驟（1）的方式，將馬拉硫磷溶液替換為待檢樣品溶液，觀察溶液顏色的變化，得到待測(cè)樣品的半定量檢測(cè)結(jié)果；（4）測(cè)定并計(jì)算待檢樣品溶液的A
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值，根據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可對(duì)待檢樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）中，所述納米金溶液中，金納米粒子的粒徑為10 nm，金納米粒子的濃度為8.1
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9 mol/L。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述納米金溶液的制備方法，過(guò)程如下：在攪拌下將1 mL 1%的HAuCl4和79 mL超純水加入到一個(gè)燒瓶中，然后在攪拌下將4 mL濃度為1%的檸檬酸鈉、0.1 m...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王耀，李兆周，陳秀金，田恒旗，段尚波，段武帥，楊海濤，高紅麗，李道敏，牛華偉，李宜芳，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：河南宜測(cè)科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：