一種人乳頭瘤病毒51型L1蛋白突變體及減少重組蛋白降解的方法及應用技術

本發明專利技術涉及醫藥生物領域，公開一種人乳頭瘤病毒51型L1蛋白突變體及其減少重組人乳頭瘤病毒51型L1蛋白降解的方法及應用。本發明專利技術采用基因工程技術對HPV51L1氨基酸序列的第422位R突變為T或Q的改造成功解決了其降解的問題。實驗表明，所做突變均不影響對應突變后L1蛋白的表達，且改造后VLP蛋白的降解比例明顯減少，也不影響對應VLP的免疫原性。因此，本發明專利技術通過對人乳頭瘤病毒51型L1蛋白突變改造后避免了其降解問題，降低了制造難度，改善了質量性狀，使得重組表達改造后序列并組裝所獲對應HPV51L1

【技術實現步驟摘要】
一種人乳頭瘤病毒51型L1蛋白突變體及減少重組蛋白降解的方法及應用


[0001]本專利技術涉及醫藥生物領域，具體涉及人乳頭瘤病毒L1蛋白的表達方法。更具體涉及人乳頭瘤病毒51型L1蛋白突變體及其減少重組人乳頭瘤病毒51型L1蛋白降解的方法及應用。

技術介紹

[0002]人乳頭瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）是一類無包膜的雙鏈DNA 病毒，其通過黏膜和皮膚微創感染上皮組織基底層細胞，引起上皮組織的良性或惡性增生性病變。高危型HPV的慢性持續性感染是誘發宮頸癌的主要病因。目前超過200多種HPV亞型被鑒定出來（http://www.hpvcenter.se/html/refclones. html）。根據World Health Organization（WHO）發布的人乳頭瘤病毒及其相關疾病的2019年總結報告（全球）和人乳頭瘤病毒及其相關疾病的2019年總結報告（中國），目前確定與誘發宮頸癌相關的HPV高危型主要有以下13個：16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68。
[0003]HPV的衣殼是一個由結構蛋白 L1和 L2 組成的正二十面體，直徑約55 nm。目前利用真核細胞，酵母或大腸桿菌均有報道可有效表達L1蛋白，且在沒有 L2 參與下72個 L1五聚體蛋白可自組裝（self
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assembly）形成病毒樣顆粒（Virus
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like Particles，VLPs）。將前述VLPs作為抗原免疫后可誘導機體產生型別特異性中和抗體，有效保護機體免受同型別病毒的感染，這是目前宮頸癌預防疫苗開發的主要策略，且國內已有4款上市品種（Cervarix，Gardasil，Gardasil 9，Cecolin）。
[0004]HPV51型屬于Alphapapillomavirus 6分支，為高危型之一。根據WHO發布的人乳頭瘤病毒及其相關疾病的2019年總結報告（全球和中國），全球宮頸癌檢測病例中HPV51亞型的檢出率接近1%，中國接近0.4%。目前已上市疫苗品種中均未包含該型別，因此我們進行了重組表達HPV51L1蛋白并將其開發成為病毒樣顆粒（VLP）疫苗的研究工作。

技術實現思路

[0005]基于大腸桿菌表達體系的HPV51L1工程菌在表達純化過程中目的蛋白HPV51L1表現出了明顯的降解情況。L1蛋白的降解影響了其作為抗原應用于預防對應型別乳頭瘤病毒感染的疫苗產品中，該蛋白降解導致免疫原性下降，從而降低其作為疫苗組分用于預防病毒感染的藥效。本專利技術人開展了HPV51L1降解問題的重點攻關工作。我們通過全面細致的質譜檢測分析研究（具體研究內容包括全長及降解L1蛋白電泳條帶膠內酶解，N/C端測序，氨基酸覆蓋率及肽段豐度對比分析等）發現：HPV51L1蛋白的降解位點為422位的精氨酸（R），而在現已報道的HPV51L1蛋白中，幾乎全部具有R422這一序列特征，我們的結構模擬分析顯示R422位于L1五聚體結構的表面。精氨酸是胰蛋白酶的水解位點。胰蛋白酶特異性作用于堿性氨基酸精氨酸或賴氨酸羧基端的肽鍵，且特異性很強。因此在重組蛋白表達過程中，HPV51L1蛋白在胰蛋白酶的作用下容易在422位精氨酸的羧基端產生了酶解斷裂。
[0006]基于我們的前述結果，為解決L1蛋白降解問題，本專利技術人嘗試用如下理化及結構特征不同的氨基酸替換422位的精氨酸（R）：丙氨酸（A）、天冬氨酸（N）、蘇氨酸（T）、天冬氨酸（D）、亮氨酸（L）、絲氨酸（S）、苯丙氨酸（F）、谷氨酰胺（Q）、組氨酸（H）。。結果顯示：將HPV51L1蛋白第422位精氨酸（R）分別替換為蘇氨酸（T）和谷氨酰胺（Q）這兩種種重組表達的蛋白突變體，其降解顯著低于未突變的野生型序列，且不影響L1五聚體進一步組裝成VLP。從而，通過對HPV51L1蛋白422位精氨酸的改造我們成功解決了該蛋白的降解問題，由此完成本專利技術。
[0007]本專利技術提供一種人乳頭瘤病毒51型L1蛋白突變體，其由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列所編碼的收氨基酸序列的第422位精氨酸替換為蘇氨酸或谷氨酰胺。
[0008]本專利技術也提供所述的突變體的編碼核酸。優選地，基于SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的第1264
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1266位3個堿基替換為ACC；或者第1265
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1266位堿基替換為AG。
[0009]本專利技術還提供所述的編碼核酸的表達載體，優選地其為原核表達載體，更優選為大腸桿菌表達載體。進一步優選地，其為誘導表達載體。更優選地，出發載體為pKL1質粒。
[0010]本專利技術進一步提供含有所述的表達載體的重組菌，優選地，其為原核細胞，更優選為大腸桿菌。更優選地，其為大腸桿菌BL21(DE3)。
[0011]本專利技術提供一種制備如人乳頭瘤病毒51型L1蛋白的方法，其包括培養所述的重組菌，和分離得到人乳頭瘤病毒51型L1蛋白的步驟。
[0012]進一步，還包括純化人乳頭瘤病毒51型L1蛋白的步驟，具體是依次采用CHT層析柱、G25脫鹽換液層析柱、Source15Q陰離子交換層析柱和分子篩層析柱進行純化。
[0013]本專利技術進而提供一種HPV51L1
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VLP的制備方法，其將所述得到的純化人乳頭瘤病毒51型L1蛋白與組裝液進行混合靜置得到，更具體地，將其與組裝液按4：1的體積比混合，室溫靜置1 h完成組裝；優選地，所述組裝液為400~600mM NaAc
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HAc，2.0~5.0 M NaCl，0.05
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0.5% Tween 80，pH4.7~6.0。
[0014]本專利技術經實驗驗證，采用基因工程技術對HPV51L1氨基酸序列進行了422位R突變為T或Q的改造成功解決了其降解的問題。前述2種改造前后各目的蛋白在表達體系中均可有效表達且大部分為可溶表達，表達量上也無明顯差異，說明HPV51L1氨基酸序列上422位R突變為T或Q均不影響對應突變后L1蛋白的表達。采用相同純化工藝制備所得最終原液的電泳結果顯示：與改造前HPV51L1
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VLP蛋白相比，改造后HPV51L1t
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VLP和HPV51L1q
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VLP蛋白的降解比例明顯減少，說明HPV51L1氨基酸序列上422位R突變為T或Q的策略成功解決了該型L1蛋白的降解問題。DLS檢測結果顯示：改造前后三種L1蛋白組裝后均可獲得直徑為44
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65 nm的病毒樣顆粒（VLP）。小鼠免疫實驗中和抗體滴度檢測結果顯示：改造前后目的蛋白引起的中和抗體滴度水平無明顯差異，說明HPV51L1氨基酸序列上422位R突變為T或Q的改造也不影響對應VLP的免疫原性。
[0015]參照《中國藥典》及專利技術人的產品質控標準：重組蛋白純度應不低于95%，降解比例應不高于5%。突變改造前野生型HPV51L1蛋白純化后降解比例大于15%，這使得用大腸桿菌重組表達并純化獲得符合前本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種人乳頭瘤病毒51型L1蛋白突變體，其特征在于，由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列所編碼的氨基酸序列的第422位精氨酸替換為蘇氨酸或谷氨酰胺。2.如權利要求1所述的突變體的編碼核酸。3.如權利要求2所述的編碼核酸，其特征在于，基于SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的第1264
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1266位3個堿基替換為ACC；或者第1265
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1266位堿基替換為AG。4.如權利要求2或3所述的編碼核酸，其特征在于，在保持編碼框不變的前提下，其5
’
端截短3~30個堿基，3
’
端截短3~90堿基。5.含有如權利要求2或3所述的編碼核酸的表達載體，優選地其為原核表達載體，更優選為大腸桿菌表達載體。6.如權利要求4所述的表達載體，其為誘導表達載體，更優選地，出發載體為pKL1質粒，具體的其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。7.含有如權利要求4或5所...

【專利技術屬性】
技術研發人員：伍樹明，劉永江，陳曉，張海江，銀飛，沈邇萃，張瑞霞，薛俊蓮，王學紅，姜旭林，王建英，
申請(專利權)人：北京康樂衛士生物技術股份有限公司，
類型：發明
國別省市：