一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗及其制備方法技術

本發明專利技術公開了一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗及其制備方法，所述活疫苗通過將豬繁殖與呼吸綜合征病毒2型毒株的N蛋白基因替換為Betaarterivirus屬病毒的N蛋白基因得到；所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒株2型毒株為SC2012株，所述Betaarterivirus屬病毒為Betaarterivirus chinrav 1，Betaarterivirus ninra，Betaarterivirus sheoin，Betaarterivirus suid 1，Betaarterivirus timiclar中的一種；制備方法包括以下工藝步驟：1)選取毒株PRRSV SC2012株F80代構建包含其基因組序列的感染性克隆載體；2)合成Betaarterivirus屬病毒的N蛋白基因并替換掉PRRSV SC2012株的N蛋白基因，使用感染性克隆載體拯救出含有特殊標記的重組病毒。本發明專利技術使得構建后獲得的載體具有特殊的標記位，能夠解決現有技術中疫苗均不能與流行毒株感染進行有效區分的技術問題，對PRRSV的防控和凈化具有重要的臨床價值。有重要的臨床價值。有重要的臨床價值。

【技術實現步驟摘要】
一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗及其制備方法


[0001]本專利技術涉及獸用生物制品
，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗及其制備方法。

技術介紹

[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以豬群發生繁殖障礙和呼吸道癥狀為主的一種急性、高度傳染性的病毒性重大傳染病。根據基因組序列和抗原特征的差異，PRRSV分為PRRSV1(以lelystad virus毒株為代表)和PRRSV2(以VR
?
2332株為代表)兩個不同的血清型。
[0003]目前國內主要以PRRSV2為主，而PRRSV2根據其基因特征可以分為9個譜系，全國范圍內存在著譜系1(亞系1.5和1.8)、3、5(亞系5.1)、8(亞系8.7)和9等5個譜系的流行。針對PRRSV的流行國內有多種疫苗可供選擇，包括譜系5衍生的經典株活疫苗VR2332株、CH1R株、R98株以及CH1a、M2株滅活疫苗以及譜系8高致病力PRRSV致弱的JXA1R株、GDr180株、HuN4
?
F112株、TJM
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F92株等。
[0004]現有疫苗均不能與流行毒株感染進行有效區分，因此研發一種能夠與流行毒株實現鑒別診斷的PRRSV標記疫苗對PRRSV的防控和凈化具有重要的臨床價值。

技術實現思路

[0005]本專利技術的目的在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗及其制備方法，通過對豬繁殖與呼吸綜合征疫苗部分序列進行替換，能夠解決現有技術中疫苗均不能與流行毒株感染進行有效區的技術問題。
[0006]為解決上述技術問題，本專利技術所采用的技術方案是：
[0007]一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，所述活疫苗通過將豬繁殖與呼吸綜合征病毒2型毒株的N蛋白基因替換為豬繁殖與呼吸綜合征病毒同屬其他病毒的N蛋白基因得到。
[0008]其中，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒株2型毒株為SC2012株，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒同屬病毒為Betaarterivirus chinrav 1，Betaarterivirus ninra，Betaarterivirus sheoin，Betaarterivirus suid 1，Betaarterivirus timiclar中的一種。
[0009]另外，本專利技術還包含了一種豬繁殖與呼吸綜合活疫苗制備方法，包括以下工藝步驟：
[0010]1)選取毒株PRRSV SC2012株F5代及F80代，F80代為連續傳代后制備而成的弱毒株，感染仔豬后無體溫反應，感染動物不發病；
[0011]2)PRRSV全基因組序列的擴增與感染性克隆的構建，具體工藝步驟如下：
[0012]按照常規方法提取PRRSV SC2012株F80代病毒RNA并進行反轉錄，使用引物進行序列擴增，按照常規方法回收擴增片段，然后將回收片段與經NheⅠ和NotⅠ酶切的pVAX1載體按
照克隆試劑盒操作說明書進行載體組裝，然后轉化TOP感受態細胞，挑選菌落提取質粒進行測序驗證，將測序正確的載體命名為pVAX
?
PRRSV SC2012；
[0013]3)人工合成Betaarterivirus屬病毒N蛋白基因序列然后使用無縫克隆替換載體pVAX
?
PRRSV SC2012中的部分序列，構建獲得的載體命名為pVAX
?
PRRSV
?
DIVA。
[0014]4)按照常規方法傳代Marc145細胞和BHK21細胞，將比例為1:1的Marc145和BHK21細胞匯合度達到70％或以上時分別轉染pVAX
?
PRRSV
?
DIVA和pVAX
?
PRRSV SC2012質粒，37℃5％ CO2培養箱中培養，轉染后72小時收獲上清，接種新傳代的Marc145細胞，37℃5％ CO2培養箱中培養，連續傳代至F5代，分別將其標注為rPRRSV
?
DIVA和rPRRSV SC2012，按照常規方法測定其F5代病毒含量分別為1E+7.8和1E+7.5TCID
50
/ml。
[0015]其中，1)中，使用引物進行序列擴增時，引物為：PRRSV
?
1F、PRRSV
?
1R、PRRSV
?
2F、PRRSV
?
2R、PRRSV
?
3F、PRRSV
?
3R、PRRSV
?
4F、PRRSV
?
4R、PRRSV
?
5F、PRRSV
?
5R、PRRSV
?
6F、PRRSV
?
6R。
[0016]在本專利技術中，各引物對應的引物序列具體為：
[0017][0018][0019]與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果：
[0020]本專利技術通過對PRRSV全基因組序列進行擴增后構建感染性克隆載體，使用無縫克隆替換載體pVAX
?
PRRSV SC2012中的部分序列，獲得新的具有特殊標記的感染性克隆載體pVAX
?
PRRSV
?
DIVA，使用pVAX
?
PRRSV
?
DIVA轉染細胞后獲得具有特殊標記的PRRSV疫苗種毒株，能夠解決現有技術中疫苗均不能與流行毒株感染進行有效區的技術問題，對PRRSV的防
控和凈化具有重要的臨床價值。
附圖說明
[0021]圖1為PRRSV SC2012、rPRRSV
?
DIVA和rPRRSV SC2012在Marc145細胞上的增值曲線。
具體實施方式
[0022]在下文中，僅簡單地描述了某些示例性實施例。正如本領域技術人員可認識到的那樣，在不脫離本專利技術實施例的精神或范圍的情況下，可通過各種不同方式修改所描述的實施例。因此，附圖和描述被認為本質上是示例性的而非限制性的。
[0023]實施例一
[0024]本實施例公開了一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，所述活疫苗通過將豬繁殖與呼吸綜合征病毒2型毒株的N蛋白基因替換為Betaarterivirus屬病毒的N蛋白基因得到。
[0025]其中，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒株2型毒株為SC2012株，所述Betaarterivirus屬病毒為Betaarterivirus chinrav 1，Betaarterivirus ninra，Betaarterivirus sheoin，Betaarterivirus suid 1，Betaarterivirus timic本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，其特征在于：所述疫苗通過將豬繁殖與呼吸綜合征病毒2型毒株的N蛋白基因替換為Betaarterivirus屬病毒的N蛋白基因得到。2.根據權利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，其特征在于：所述的Betaarterivirus屬病毒為Betaarterivirus chinrav 1，Betaarterivirus ninra，Betaarterivirus sheoin，Betaarterivirus suid 1，Betaarterivirus timiclar中的一種。3.根據權利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，其特征在于：所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒株2型毒株為SC2012株。4.根據權利要求1所述的一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，其特征在于：所述疫苗的基因組序列包括如序列2所示的核苷酸序列。5.一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗制備方法，其特征在于，包括以下工藝步驟：1)選取毒株PRRSV SC2012株F5代及F80代，F80代為連續傳代后制備而成的弱毒株，感染仔豬后無體溫反應，感染動物不發病；2)PRRSV全基因組序列的擴增與感染性克隆的構建，具體工藝步驟如下：按照常規方法提取PRRSV SC2012株F80代病毒RNA并進行反轉錄，使用引物進行序列擴增，按照常規方法回收擴增片段，然后將回收片段與經NheⅠ和NotⅠ酶切的pVAX1載體按照克隆試劑盒操作說明書進行載體組裝，然后轉化TOP感受態細胞，挑選菌落提取質粒進行測序驗證，將測序正確的載體命名為pVAX
?
PRRSV SC2012；3)合成Betaarterivirus屬毒株N蛋白基因序列,替換載體pVAX
?
PRRSV SC2012中的部分序列，構建獲得的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周遠成，湯文杰，魏小蘭，鄺山，李書偉，
申請(專利權)人：畜科生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：