用于RT-LAMP擴增試劑的緩沖劑及RT-LAMP擴增試劑制造技術(shù)

本申請涉及RT

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
用于RT
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LAMP擴增試劑的緩沖劑及RT
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LAMP擴增試劑


[0001]本申請涉及RT
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LAMP擴增技術(shù)，尤其涉及一種用于RT
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LAMP擴增試劑的緩沖劑及RT
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LAMP擴增試劑。

技術(shù)介紹

[0002]LAMP(Loop
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Mediated Isothermal Amplification)技術(shù)依賴于識別保守序列DNA的4
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6條特異性引物和一種具有鏈置換功能的DNA聚合酶（如Bst DNA polymerase）在約65℃的恒溫條件下處理一小時即可實現(xiàn)對靶分子的109?
10
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倍擴增。LAMP檢測方法具有效率高、耗時短、通量大、不依賴儀器、結(jié)果可直接肉眼觀察、操作簡單等優(yōu)勢，能夠同時檢測大批量的病理樣本，非常適合基層快速診斷，具有巨大的未來市場價值。
[0003]RT
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LAMP 擴增試劑在擴增反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量H
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，使反應(yīng)前后的pH 發(fā)生較大的變化，通過在擴增反應(yīng)液中加入常用的Tris
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HCl緩沖液及酚紅指示劑，可有效指示反應(yīng)液變化；當(dāng)在pH 大于8.0時呈現(xiàn)紫紅色，在pH小于6.8 時呈現(xiàn)黃色，通過肉眼即可根據(jù)顏色的變化判斷反應(yīng)的陰陽性；因此，pH 指示劑法RT
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LAMP因其結(jié)果可肉眼區(qū)分被廣泛應(yīng)用。
[0004]但在實際應(yīng)用過程中，反應(yīng)前后顏色的變化對反應(yīng)體系中的緩沖液的量要求較高，其添加量太多會導(dǎo)致RT
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LAMP 反應(yīng)產(chǎn)生的H
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被中和，其添加量較少，使試劑容易受到環(huán)境中的CO2的影響而變酸，容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本申請?zhí)峁┮环N用于RT
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LAMP擴增試劑的緩沖劑及RT
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LAMP擴增試劑，所提供的緩沖劑可以既保證其不受環(huán)境中的CO2影響，又可以保證其不被反應(yīng)過程中產(chǎn)生的H
+
中和。
[0006]本申請所提供的第一種方案為：用于RT
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LAMP擴增試劑的緩沖劑，包括體積摩爾濃度為2mM的Tris
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HCl、2~10mM的葡萄糖酸鈉及2~10mM的甲酸鈉。
[0007]可選的，包括體積摩爾濃度為2mM的Tris
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HCl、2mM的葡萄糖酸鈉及2mM的甲酸鈉。
[0008]本申請還提供一種RT
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LAMP擴增試劑，包括前述所述的緩沖劑、RT
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LAMP 擴增所需的非酶原料、RT
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LAMP 擴增所需的酶原料以及pH指示劑；所述緩沖劑包括體積摩爾濃度為2mM的Tris
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HCl、2~10mM的葡萄糖酸鈉、2~10mM的甲酸鈉。
[0009]可選的，所述緩沖劑包括體積摩爾濃度為2mM的Tris
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HCl、2mM的葡萄糖酸鈉、2mM的甲酸鈉。
[0010]可選的，所述RT
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LAMP 擴增所需的非酶原料包含體積摩爾濃度為20~60mM的KCl、3~5mM的MgCl2、5~9mM的dNTPS。
[0011]可選的，所述RT
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LAMP 擴增所需的酶原料包含10~60U的逆轉(zhuǎn)錄酶、10~20U的RNAase抑制劑、20~150U的Bst酶。
[0012]可選的，所述pH 指示劑包含質(zhì)量百分比為0.1%~1%的酚紅和0.03%~0.3%的姜黃素。
[0013]可選的，所述擴增試劑由前述所述的緩沖劑、RT
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LAMP 擴增所需的非酶原料、RT
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LAMP 擴增所需的酶原料以及pH指示劑組成；所述緩沖劑由體積摩爾濃度為2mM的Tris
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HCl、2mM的葡萄糖酸鈉、2mM的甲酸鈉組成；所述RT
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LAMP 擴增所需的非酶原料由60mM的KCl、5mM的MgCl2、9mM的dNTPS組成；所述RT
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LAMP 擴增所需的酶原料由60U的逆轉(zhuǎn)錄酶、20U的RNAase抑制劑、150U的Bst酶組成；所述pH 指示劑由質(zhì)量百分比為0.1%的酚紅和0.03%的姜黃素組成。
[0014]可選的，所述緩沖劑的pH為7.8。
[0015]可選的，所述RT
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LAMP擴增試劑反應(yīng)的靈敏度最低可到每個反應(yīng)10 拷貝，反應(yīng)的顏色變化由紫紅色變成亮黃色。
[0016]本申請通過在低濃度的Tris
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HCl液中添加2~10mM的葡萄糖酸鈉與2~10mM 甲酸鈉混合物，可以既保證其不受環(huán)境中的CO2影響，又可以保證其不被反應(yīng)過程中產(chǎn)生的H
+
中和。甲酸鈉和葡糖糖酸鈉二者作為強堿弱酸鹽，低濃度的甲酸鈉和葡萄糖酸鈉呈弱堿性，可以中和溶解在水溶液中的空氣中的CO2，同時不使緩沖體系的pH 發(fā)生較大的變化。
具體實施方式
[0017]為使本申請實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本申請實施例，對本申請實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本申請一部分實施例，而不是全部的實施例。通常在此處描述和示出的本申請實施例的組件可以以各種不同的配置來布置和設(shè)計。
[0018]以下是對本申請方案的詳細說明：本申請通過在低濃度的Tris
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HCl 緩沖液中添加2~10mM的葡萄糖酸鈉與2~10mM的甲酸鈉混合物，可以既保證緩沖液不受環(huán)境中的CO2影響，又可以保證反應(yīng)過程中產(chǎn)生的H
+
不被緩沖液中和。
[0019]此外，本申請還對pH指示劑進行了調(diào)整。現(xiàn)有常規(guī)使用的pH指示劑多是單獨以酚紅為指示劑，在pH 大于8.0時呈現(xiàn)紫紅色，在pH小于6.8 時呈現(xiàn)黃色，當(dāng)體系中的待擴增模板濃度較低時，即使產(chǎn)生了H
+
，但反應(yīng)的PH 變化仍較小，顏色變化不明顯，無法與反應(yīng)前的顏色明確區(qū)分。本申請優(yōu)化將pH指示劑調(diào)整為酚紅和姜黃素的混合物可以使pH≧8.0的反應(yīng)液呈現(xiàn)紫色，pH<8.0 的反應(yīng)液呈現(xiàn)黃色，該混合物組合所得的指示劑極大提高了低濃度模板在反應(yīng)前后的顏色區(qū)分度，提高了擴增試劑的靈敏度。
[0020]綜上，本申請原理大致如下：1、甲酸鈉和葡糖糖酸鈉二者作為強堿弱酸鹽，低濃度的甲酸鈉和葡萄糖酸鈉呈弱堿性，可以中和溶解在水溶液中的空氣中的CO2，同時不使緩沖體系的pH 發(fā)生較大的變化。
[0021]2、姜黃素作為pH 指示劑，其在pH為7.8時呈黃色，在pH為9.2 時為紅棕色；酚紅作為指示劑，其在pH 大于8.0時呈現(xiàn)紫紅色，在pH小于6.8 時呈現(xiàn)黃色；姜黃素與酚紅的混合物可以促使其縮小顏色變化pH區(qū)間，顏色變化更靈敏，并且使反應(yīng)后的顏色更亮黃，增加肉本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
1.用于RT
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LAMP擴增試劑的緩沖劑，其特征在于，包括體積摩爾濃度為2mM的Tris
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HCl、2~10mM的葡萄糖酸鈉及2~10mM的甲酸鈉。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的緩沖劑，其特征在于，包括體積摩爾濃度為2mM的Tris
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HCl、2mM的葡萄糖酸鈉及2mM的甲酸鈉。3.一種RT
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LAMP擴增試劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的緩沖劑、RT
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LAMP 擴增所需的非酶原料、RT
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LAMP 擴增所需的酶原料以及pH指示劑；所述緩沖劑包括體積摩爾濃度為2mM的Tris
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HCl、2~10mM的葡萄糖酸鈉、2~10mM的甲酸鈉。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的RT
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LAMP擴增試劑，其特征在于，所述緩沖劑包括體積摩爾濃度為2mM的Tris
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HCl、2mM的葡萄糖酸鈉、2mM的甲酸鈉。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的RT
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LAMP擴增試劑，其特征在于，所述RT
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LAMP 擴增所需的非酶原料包含體積摩爾濃度為20~60mM的KCl、3~5mM的MgCl2、5~9mM的dNTPS。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的RT
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LAMP擴增試劑，其特征在于，所述RT
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LAMP 擴增所需的酶原料包含...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：宋東亮，馬海玲，孫曉亮，
申請(專利權(quán))人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：