利用組織培養技術高效繁殖多年生野生大豆的方法技術

一種農業技術領域的利用組織培養技術高效繁殖多年生野生大豆的方法，包括以下步驟：第一步，種子滅菌，劃破種皮，在萌發培養基上培養無菌苗。第二步，待無菌苗長至１０ｃｍ，切下無菌苗幼莖頂端３－４ｃｍ插入生根培養基。第三步，將切去頂端的實生苗移栽到滅菌的基質或土中，待長出新枝移至戶外。一周后移栽到田間或盆栽。第四步，將第二步得到的幼莖在生根培養基中培養至生根。采用上述方法，多年生野生大豆的成活率可以達到９９％－１００％，本發明專利技術可用于多年生野生大豆Ｇｌｙｃｉｎｅ亞屬２２個種的材料的繁殖，并可為大豆屬其它種、屬內或與其它屬間雜種的無菌播種和繁殖提供方法。

【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種農業
的繁殖野生大豆的方法，具體涉及一種利用組 織培養技術高效繁殖多年生野生大豆的方法。技術背景多年生野生大豆是豆科(Leguminosae)、蝶形花亞科(Papiliomatae)、大豆 屬、Glycine亞屬。Glycine亞屬有22個多年生野生種。主要分布在澳大利亞 及南太平洋島嶼，我國臺灣及福建、廣東沿海島嶼有G.tabacinaBenth.(煙豆) 和G. tomentella Hayata (短絨野大豆)2個種分布。大豆屬還有soya亞屬， 有兩個種，分別是栽培大豆(G. maxMerr.)和一年生野生大豆(G. soja Sieb. & Zucc.)。 一年生野生大豆是栽培大豆的祖先。野生大豆遍布東亞的中國、朝鮮、 日本及俄羅斯遠東地區。栽培大豆起源于中國。大豆屬物種二倍體的基因組 2n=40。單倍體基因組分析、RFLP標記分析表明大豆是一個古四倍體，其基因組 經過長期進化而二倍化。由于人類的干預，野生大豆資源的棲息地不斷縮減，這 些植物資源如同石油，礦產一樣，是不可再生的。野生大豆被列為國家二級保護 植物。Glycine亞屬的野生種和栽培大豆相比，很多性狀具有潛在的應用價值， 如中日性、耐熱、耐旱、耐冷、耐鹽、抗大豆孢囊線蟲、抗花葉病毒病、抗根腐 病、花序多花性、莢的多粒性等。但迄今將野生多年生大豆的外源性狀引入栽培 大豆尚未成功。隨著有性雜交和體細胞雜交研究的不斷深入，以及基因克隆及基 因轉移技術的應用，可望使以前大豆改良中難以利用的種質資源加入大豆的育種 計劃中。野生大豆都具有厚厚的種皮，或者種皮外長有泥膜，可以防止種子在不利生 長的環境中因遇水吸漲而過早萌發。這個特性對于生長在原生境下野生大豆非常 有利，但是對于需要在栽培條件下栽培和繁殖的野生大豆資源來講，對于播種及 出苗是不利的。尤其對于種子數量很少的多年生野生大豆資源，其繁殖主要存在兩個問題 一是出苗率低。為使多年生野生大豆的種子及時萌發，常規的方法是 在播種前破壞種皮，然后播種于土壤或基質中。但在田間種植時，過早劃破種皮 的種子往往受到土壤中微生物的影響，損失部分種子。在種子萌發后至成為壯苗 之前，會遇到土壤害蟲的為害，也會降低成苗率。另一個問題是，多年生野生大 豆一粒種子只能長出一棵幼苗，對于在苗期材料，或者那些根部不能發出新枝的 材料來說， 一粒種子只能長成一棵植株，如果在收獲成熟種子之前遇到不利環境， 造成植株死亡就不能留下后代。經對現有技術的文獻檢索發現，中國專利申請號200410050905.6,專利技術名稱為萬帶蘭的無菌播種和組織培養技術，該專利提出涉及一種萬帶蘭的無菌播種和組織培養技術，采用人工營養基利用無菌播種的方法能獲得大量試管苗，并 利用無菌實生苗的莖尖或莖節進行叢生芽的增殖并通過生根培養能形成完整植 株。該專利涉及萬帶蘭的無菌播種和組織培養繁殖的方法及所使用的培養基。是 利用無菌播種，利用無菌實生苗的莖尖或莖節進行叢生芽的增殖。這種方法往往 是利用無菌實生苗來得到莖尖，節間等來產生叢生芽，進行大量繁殖，而對于實 生苗本身不再利用，這樣對于一些珍稀材料，或種子很少的材料來講，直接采用 組織培養方式進行大量繁殖會有一些風險，必須保證有一定數量的種子，才能進 行組織培養的方法增殖。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對現有技術的不足，提出一種利用組織培養技術高效繁 殖多年生野生大豆的方法，既解決了種子數量少，進行組織培養方法增殖會損失 種子的風險，也解決了目前多年生野生大豆繁殖出苗率低，以及在收獲成熟種子 之前遇到不利環境或因素，植株整株死亡，不能留下后代的問題。本專利技術是通過以下技術方案實現的，根據繁殖材料性質和種子的數量的差 別，可以采用以下兩種方案，即在種子數量極少，每份遺傳上同質的材料只有l-2粒種子時，采用方法一；當要繁殖的材料有2粒以上的種子，采用方法二。 所述方法一，包括以下步驟第一步，種子滅菌及多年生野生大豆無菌苗的獲得取成熟的多年生野生大 豆種子，用氯氣或過飽和漂白粉精片溶液進行種子滅菌，用手術刀將種皮劃破。將劃破種皮的多年生野生大豆種子接種到萌發培養基上，經過培養得到無菌苗， 為第二步提供植物材料。如果只用種子直接繁殖，不需要組織培養增殖，此 步驟不需要種子滅菌。所述萌發培養基為現有的MS培養基、Bs培養基或MS培養基的無機成分加上 Bs培養基的有機成分，培養溫度為24'C-26'C。第二步，增殖及生根待實生苗長至10cm，從無菌苗頂端向下3cm-4cm處切 下莖端，將無菌苗莖段的植物學下端插入生根培養基中生根，作為第四步的材料； 切去頂端的野生大豆實生苗作為第三步的材料。所述生根培養基為MS固體培養基，培養溫度為24°C-26°C。為第三步的盆栽 及第四步的繼續增殖準備材料。第三步，盆栽將裝有切去頂端的實生苗的瓶子打開，在培養室內生長3天， 移栽到裝有滅菌的基質(或土)的盆中。在24'C-26'C條件下培養，待長出新枝 后，將盆轉移到戶外。盆栽野生大豆在戶外生長一周后移栽到田間。如果該材料 不能在當地室外越冬，則采用盆栽方式。第四步，第二步得到的已經生根的實生苗頂端幼莖，在生根培養基中經過半 個月的培養，長出很多健康的根。如果需要繼續繁殖，可以將已經伸長的莖端切 下，重復第二步的步驟。所述方法二，包括以下步驟第一步，種子萌發取成熟的多年生野生大豆種子，用手術刀將種皮劃破。將劃破種皮的多年生野生大豆種子接種到萌發培養基上，使種子萌發，為第二 步提供植物材料。所述萌發培養基為現有的MS培養基、B5培養基或MS培養基的無機成分加上 B5培養基的有機成分，培養溫度為24'C-26'C。第二步，盆栽待種子萌發3-4天，種子長出幼根，脫掉種皮，將幼苗植入 經過滅菌的土壤或基質中， 一個月后，換盆移栽到田間。如果該材料不能在當地 室外越冬，則采用盆栽方式。本專利技術雖然也是使用無菌播種及組織培養技術，但不同的是在無菌苗長到足 夠大之后，切下上端，將帶有正常根系的下端移栽到土壤或基質中，使其成苗。這樣用來播種得到無菌實生苗的種子也長成一棵植株，對于種子稀少的材料或雜 交得到的種子可以采用這種方式繁殖，采用這種方法可以保證每一粒種子都能夠 得到健康的植株，同時利用組織培養的方式大量繁殖遺傳上同質的植株。另外實 生苗的根系強壯，將培養基中的實生苗移栽得到的植株，比經過叢生芽生根得到 的植株強壯，根系發達，生長迅速，開花，結實早，移栽的成活率高。另外對于 多年生野生大豆的繁殖，現有技術中尚沒有使用無菌播種組織:培養繁殖。采用上述兩種方法，從方法一的第一步至第三步，方法二的第一步至第二步， 如果沒有人為操作失誤，種子的成苗率可以達到99%-100%。方法一經過第四步， 一粒多年生野生大豆種子可以得到兩株或兩株以上更多的在遺ft上同質的植株。 該方法也可以用于雜交種F。代的繁殖，用較少的F。種子得到較多同質的F,植株， 并得到更多的R種子。這樣對于雜交困難或者結實周期長的物禾中來說，只要一次 雜交成功， 一粒雜交種子就可以繁殖多個F,植株。因此這種方法不但可以用于資 源的繁殖、保存，還可以用于雜交育種及科學研究，可以最大限度地利用種子及 種質資源繁殖材料。本專利技術可用于多年生野生大豆Gl本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用組織培養技術高效繁殖多年生野生大豆的方法，其特征在于，包括以下步驟：第一步，種子滅菌及多年生野生大豆無菌苗的獲得：取成熟的多年生野生大豆種子，用氯氣或過飽和漂白粉精片溶液進行種子滅菌，用手術刀將種皮劃破，將劃破種皮的多年生野生大豆種子接種到萌發培養基上，經過培養得到無菌苗，為第二步提供植物材料；所述萌發培養基為現有的ＭＳ培養基，Ｂ↓［５］培養基，或ＭＳ培養基的無機成分加上Ｂ↓［５］培養基的有機成分；第二步，增殖及生根：待實生苗長至１０ｃｍ，從無菌苗頂端向下３ｃｍ－４ｃｍ處切下莖端，將無菌苗莖段的植物學下端插入生根培養基中生根，作為第四步的材料，切去頂端的野生大豆實生苗作為第三步的材料；所述生根培養基為ＭＳ固體培養基；第三步，盆栽：將裝有切去頂端的實生苗的瓶子打開，在培養室內生長３天，再移栽到裝有滅菌的基質或土的盆中，待長出新枝后，將盆轉移到戶外，盆栽野生大豆在戶外生長一周后移栽到田間；第四步，第二步得到的已經生根的實生苗頂端幼莖，在生根培養基中經過半個月的培養，長出很多健康的根。

【技術特征摘要】
1. 一種利用組織培養技術高效繁殖多年生野生大豆的方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，種子滅菌及多年生野生大豆無菌苗的獲得取成熟的多年生野生大豆種子，用氯氣或過飽和漂白粉精片溶液進行種子滅菌，用手術刀將種皮劃破，將劃破種皮的多年生野生大豆種子接種到萌發培養基上，經過培養得到無菌苗，為第二步提供植物材料；所述萌發培養基為現有的MS培養基，B5培養基，或MS培養基的無機成分加上B5培養基的有機成分；第二步，增殖及生根待實生苗長至10cm，從無菌苗頂端向下3cm-4cm處切下莖端，將無菌苗莖段的植物學下端插入生根培養基中生根，作為第四步的材料，切去頂端的野生大豆實生苗作為第三步的材料；所述生根培養基為MS固體培養基；第三步，盆栽將裝有切去頂端的實生苗的瓶子打開，在培養室內生長3天，再移栽到裝有滅菌的基質或土的盆中，待長出新枝后，將盆轉移到戶外，盆栽野生大豆在戶外生長一周后移栽到田間；第四步，第二步得到的已經生根的實生苗頂端幼莖，在生根培養基中經過半個月的培養，長出很多健康的根。...

【專利技術屬性】
技術研發人員：曹越平，
申請(專利權)人：上海交通大學，
類型：發明
國別省市：31[]