重組人偏肺病毒F蛋白及其用途制造技術(shù)

公開了在融合前或融合后構(gòu)象下穩(wěn)定的偏肺病毒(HMPV)F胞外域三聚體，編碼這些蛋白質(zhì)的核酸分子和載體，以及它們的使用和產(chǎn)生方法。在幾個實施方案中，HMPV F胞外域三聚體和/或核酸分子可用于在受試者中產(chǎn)生對HMPV的免疫反應(yīng)。在另外的實施方案中，在治療或預(yù)防HMPV感染的方法中，可以向受試者施用治療有效量的HMPV F胞外域三聚體和/或核酸分子。F胞外域三聚體和/或核酸分子。F胞外域三聚體和/或核酸分子。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】重組人偏肺病毒F蛋白及其用途
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求于2020年4月29日提交的美國臨時申請?zhí)?3/017,581的優(yōu)先權(quán)，該申請通過引用以其全文并入本文。


[0003]本公開涉及用于治療和預(yù)防HMPV感染和疾病的重組人偏肺病毒(metapneumovirus,HMPV)F蛋白及其免疫原性片段。

技術(shù)介紹

[0004]HMPV是副粘病毒科(Paramyxoviridae)、肺病毒屬(Pneumovirus)的有包膜的非節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒。它是兒童和老年人之中毛細支氣管炎和肺炎的常見原因。HMPV還引起反復(fù)感染，包括重度下呼吸道疾病，這可能在任何年齡發(fā)生，尤其是老年人或心臟、肺或免疫系統(tǒng)受損的人。目前的治療包括施用抗病毒劑Ribaviran。
[0005]在自然界中，HMPV F蛋白最初表達為單一多肽前體，稱為F0。F0在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中三聚化，并在保守的裂解位點被蛋白水解加工，產(chǎn)生F1和F2多肽。三個F2?
F1異二聚體的原體組裝形成成熟的三聚體F蛋白，其具有亞穩(wěn)態(tài)融合前構(gòu)象，可被引發(fā)構(gòu)象變化，使病毒和靶細胞膜融合。由于其在HMPV進入中的必然的作用，HMPV F蛋白是中和抗體的靶標(biāo)和疫苗開發(fā)的對象；然而，與其他HMPV抗原一樣，先前開發(fā)基于HMPV F蛋白的疫苗的努力已被證明是不成功的。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0006]本文公開了重組HMPV F胞外域三聚體，其包含包括一個或更多個氨基酸取代的原體，該氨基酸取代引入非天然二硫鍵，以使F蛋白三聚體在融合前構(gòu)象或融合后構(gòu)象下穩(wěn)定。如實例中所述，此類重組HMPV F胞外域三聚體引發(fā)優(yōu)異的免疫反應(yīng)。
[0007]在一些實施方案中，提供了重組HMPV F胞外域三聚體，其通過三聚體的原體中的一個或更多個氨基酸取代而在融合前構(gòu)象下穩(wěn)定，該氨基酸取代包含形成非天然原體間二硫鍵的HMPV F第84和249位的半胱氨酸取代(例如V84C/A249C取代)，或形成非天然原體內(nèi)二硫鍵的HMPV F第140和147位的半胱氨酸取代(例如A140C/A147C取代)，或形成非天然原體間二硫鍵的HMPV F第84和249位的半胱氨酸取代(例如V84C/A249C取代)以及形成非天然原體內(nèi)二硫鍵的HMPV F第140和147位的半胱氨酸取代(例如A140C/A147C取代)。在一些實施方案中，一個或更多個氨基酸取代進一步包含HMPV F第131、143、145、163和459位中的一個或更多個位置的脯氨酸取代，例如，一個或更多個氨基酸取代進一步包含E131P、R163P，和A459P取代。在一些實施方案中，一個或更多個氨基酸取代進一步包含HMPV F第454和458位或HMPV F第365和455位的半胱氨酸取代以引入非天然二硫鍵。在另外的實施方案中，一個或更多個氨基酸取代進一步包含將HMPV F第89
?
112位取代成GSGGSG(SEQ ID NO:146)以去除F1/F2蛋白酶裂解位點。
[0008]在一些實施方案中，提供了重組HMPV F胞外域三聚體，其通過三聚體的原體中的一個或更多個氨基酸取代而在融合后構(gòu)象下穩(wěn)定，該氨基酸取代包含與HMPV F第60位的半胱氨酸形成非天然原體內(nèi)二硫鍵的HMPV F第63位的半胱氨酸取代(例如G63C取代)，或與HMPV F第180位的半胱氨酸形成非天然原體間二硫鍵的HMPV F第188位的半胱氨酸取代(例如K188C取代)，或與HMPV F第60位的半胱氨酸形成非天然原體內(nèi)二硫鍵的HMPV F第63位的半胱氨酸取代(例如G63C取代)以及與HMPV F第180位的半胱氨酸形成非天然原體間二硫鍵的HMPV F第188位的半胱氨酸取代(例如K188C取代)。在一些實施方案中，在融合后構(gòu)象下穩(wěn)定的重組HMPV F胞外域三聚體的原體進一步包含HMPV F第140、147、450和/或470位的半胱氨酸取代(例如A140C、A147C、K450C和S470C取代)。
[0009]在一些實施方案中，重組HMPV F胞外域三聚體的原體進一步包含一個或更多個另外的氨基酸取代或缺失，例如使重組HMPV F胞外域三聚體在融合前或融合后構(gòu)象下穩(wěn)定的氨基酸取代，或抑制或阻止在F胞外域的F1/F2蛋白酶裂解位點的蛋白酶裂解的氨基酸取代。
[0010]在一些實施方案中，重組HMPV F胞外域三聚體的原體可以與三聚化結(jié)構(gòu)域(例如T4纖維蛋白三聚化結(jié)構(gòu)域)連接。在另外的實施方案中，重組HMPV F胞外域三聚體的原體可以是膜錨定的，例如，通過與跨膜結(jié)構(gòu)域連接。
[0011]在另外的實施方案中，重組HMPV F胞外域三聚體可以被包括在自組裝蛋白納米顆粒上，例如鐵蛋白納米顆粒，或合成的基于蛋白的納米顆粒。還提供了編碼公開的重組HMPV F胞外域三聚體的原體的核酸分子，以及包括該核酸分子的載體，和產(chǎn)生所公開的重組HMPV F胞外域三聚體的方法。
[0012]還提供了包括重組HMPV F胞外域三聚體的免疫原性組合物，其適合于給受試者施用，并且還可以被包含在單位劑型中。該組合物可以進一步包括佐劑。重組HMPV F胞外域三聚體還可以與載體綴合以便于呈遞至免疫系統(tǒng)。
[0013]公開了在受試者中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，以及通過向受試者施用有效量的公開的重組HMPV F胞外域三聚體、核酸分子或載體以治療、抑制或預(yù)防受試者的HMPV F感染的方法。
[0014]本公開的前述和其他特征和優(yōu)點將從以下參照附圖進行的幾個實施方案的詳細描述變得更加顯而易見。
附圖說明
[0015]圖1A
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1D：融合前狀態(tài)的基于原體間二硫鍵穩(wěn)定化的HMPV F三聚體。(圖1A)在HMPV F(PDB ID 5WB0)的融合前結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，基于結(jié)構(gòu)的原體間二硫鍵設(shè)計。(圖1B)二硫鍵穩(wěn)定化的融合前HMPV F的特性。左圖，表達水平。右圖，不存在(
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)和存在(+)還原劑(DTT，二硫蘇糖醇)條件下的原體間二硫鍵穩(wěn)定化的HMPV F融合前變體的SDS
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PAGE分析。(圖1C)與用原體間84C
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249C和原體內(nèi)140C
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147C穩(wěn)定的HMPV F三聚體復(fù)合的MPE33 Fab的分辨率的Cryo
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EM 3D重建。密度以透明灰色顯示，HMPV F呈帶狀，以融合前和融合后構(gòu)象之間的距離顯示陰影(基于PDB 5wb0和5l1x)。(圖1D)“頭部”區(qū)域中融合前殘基113
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179的特寫，其中清晰的密度顯示殘基113
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179處于融合前構(gòu)象。140/147殘基的接近程度被顯示。
[0016]圖2A
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2D：融合后狀態(tài)的HMPV F三聚體基于原體間二硫鍵的穩(wěn)定化。(圖2A)HMPV亞
型A1(NL/1/00)和B2(CAN98
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75)以及相應(yīng)HMPV F變體v4
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A和v4
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B的融本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】1.一種免疫原，所述免疫原包含：重組人偏肺病毒(HMPV)F胞外域三聚體，其通過所述三聚體的原體中的一個或更多個氨基酸取代在融合前構(gòu)象下穩(wěn)定，所述氨基酸取代包含：形成非天然二硫鍵的V84C和A249C取代；形成非天然二硫鍵的A140C和A147C取代；和將HMPV F第89
?
112位(LAREEQIENPRQSRFVLGAIALGV，SEQ ID NO:243)取代成GSGGSG(SEQ ID NO:146)；以及任選地進一步包含E131P、R163P和A459P取代；形成非天然二硫鍵的T365C和Q455C取代；和/或形成非天然二硫鍵的V84C和A249C取代；和其中氨基酸編號根據(jù)如SEQ ID NO:7所示的參考HMPV F序列確定。2.一種免疫原，所述免疫原包含：重組人偏肺病毒(HMPV)F胞外域三聚體，其通過所述三聚體的原體中的一個或更多個氨基酸取代在融合前構(gòu)象下穩(wěn)定，所述氨基酸取代包含形成非天然原體間二硫鍵的HMPV F第84和249位的半胱氨酸取代，和/或形成非天然原體內(nèi)二硫鍵的HMPV F第140和147位的半胱氨酸取代。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫原，其中所述HMPV F第84和249位的半胱氨酸取代是V84C/A249C取代，并且所述HMPV F第140和147位的半胱氨酸取代是A140C/A147C取代。4.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的免疫原，其中所述一個或更多個氨基酸取代進一步包含HMPV F第154和396位、第454和458位、第141和161位、第26和439位、第45和157位、第51和166位、第80和224位、第86和212位、第103和366位、第103和366位、第106和321位、第365和455位、以及第293和443位中的一個或更多個位置的半胱氨酸取代以引入非天然二硫鍵。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原，其中所述取代是G154C和R396C取代、D454C和V458C取代、L141C和A161C取代、E26C和G439C取代、T45C和V157C取代、E51C和K166C取代、E80C和D224C取代、A86C和G212C取代、F103C和G366C取代、F103C和G366C取代、G106C和P321C取代、T365C和Q455C取代、和/或S293C和S443C取代。6.根據(jù)權(quán)利要求2
?
5中任一項所述的免疫原，其中所述一個或更多個氨基酸取代進一步包含HMPV F第131、143、145、163和459位中的一個或更多個位置的脯氨酸取代。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫原，包含E131P、R163P和A459P取代。8.根據(jù)權(quán)利要求2
?
7中任一項所述的免疫原，其中所述重組HMPV F胞外域的原體進一步包含抑制F1/F2蛋白酶裂解位點處的蛋白酶裂解的突變。9.根據(jù)權(quán)利要求2
?
8中任一項所述的免疫原，其中所述重組HMPV F胞外域三聚體的原體是包含一個或更多個氨基酸取代以去除F1/F2蛋白酶裂解位點的單鏈蛋白，并且其中F2多肽和F1胞外域通過異源肽接頭連接，或直接連接。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的免疫原，其中所述異源肽接頭連接HMPV F第88和113位、第96和103位、第97和10位3、第98和103位、第100和103位、或第101和103位。11.根據(jù)權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所述的免疫原，其中通過將殘基89
?
112取代成六氨基
酸甘氨酸
?
絲氨酸接頭，對所述F1/F2蛋白酶裂解位點進行突變。12.根據(jù)權(quán)利要求9
?
11中任一項所述的免疫原，其中通過將HMPV F第99
?
102位取代成GGGG、將HMPV第97
?
102位取代成GGGGGG(SEQ ID NO:147)或?qū)MPV F第89
?
112位取代成GSGGSG(SEQ ID NO:146)，對所述F1/F2蛋白酶裂解位點進行突變。13.根據(jù)權(quán)利要求2
?
12中任一項所述的免疫原，其中所述一個或更多個氨基酸取代包含：形成非天然二硫鍵的V84C和A249C取代，形成非天然二硫鍵的A140C和A147C取代，以及將HMPV F第97
?
102位取代成GGGGGG(SEQ ID NO:147)；形成非天然二硫鍵的V84C和A249C取代，形成非天然二硫鍵的A140C和A147C取代，以及將HMPV F第89
?
112位取代成GSGGSG(SEQ ID NO:146)；形成非天然二硫鍵的V84C和A249C取代，形成非天然二硫鍵的A140C和A147C取代，形成非天然二硫鍵的T365C和Q455C，以及將HMPV F第89
?
112位取代成GSGGSG(SEQ ID NO:146)；形成非天然二硫鍵的V84C和A249C取代，形成非天然二硫鍵的A140C和A147C取代，形成非天然二硫鍵的D454C和V458C，以及將HMPV F第89
?
112位取代成GSGGSG(SEQ ID NO:146)；形成非天然二硫鍵的V84C和A249C取代，形成非天然二硫鍵的A140C和A147C取代，將HMPV F第89
?
112位取代成GSGGSG(SEQ ID NO:146)，以及E131P、R163P和A459P取代；形成非天然二硫鍵的V84C和A249C取代，取代形成非天然二硫鍵的A140C和A147C，形成非天然二硫鍵的T365C和Q455C，將HMPV F第89
?
112位取代成GSGGSG(SEQ ID NO:146)，以及E131P、R163P和A459P取代；或形成非天然二硫鍵的V84C和A249C取代，形成非天然二硫鍵的A140C和A147C取代，形成非天然二硫鍵的D454C和V458C，將HMPV F第89
?
112位取代成GSGGSG(SEQ ID NO:146)，以及E131P、R163P和A459P取代。14.根據(jù)權(quán)利要求2
?
13中任一項所述的免疫原，其中所述重組HMPV F胞外域三聚體的原體包含一個或更多個氨基酸取代，以及與以下具有至少90％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:8
?
28或107
?
120中任一個的殘基1
?
466，或SEQ ID NO:121
?
123、125
?
128、130
?
132、134
?
145或148
?
207中任一個的殘基1
?
448，或SEQ ID NO:124、129或133中任一個的殘基1
?
449。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫原，其中所述重組HMPV F胞外域三聚體中的原體包含如下所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:8
?
28或107
?
120中任一個的殘基1
?
466，或SEQ IDNO:121
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123、125
?
128、130
?
132、134
?
145或148
?
207中任一個的殘基1
?
448，或SEQ IDNO:124、129或133中任一個的殘基1
?
449。16.一種免疫原，所述免疫原包含：重組HMPV F胞外域三聚體，其通過所述三聚體的原體中的一個或更多個氨基酸取代在融合后構(gòu)象下穩(wěn)定，所述氨基酸取代包含與HMPV F第60位的半胱氨酸形成非天然原體內(nèi)二硫鍵的HMPV F第63位的半胱氨酸取代，和/或與HMPV F第180位的半胱氨酸形成非天然原體間二硫鍵的HMPV F第188位的半胱氨酸取代。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的免疫原，其中所述HMPV F第63位的半胱氨酸取代是G63C取代，并且所述HMPV F第188位的半胱氨酸取代是K188C取代。18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的免疫原，其中所述原體進一步包含HMPV F第140、147、
450和470位的半胱氨酸取代。19.根據(jù)權(quán)利要求16
?
18中任一項所述的免疫原，其中HMPV F第140、147、450和470位的半胱氨酸取代是A140C、A147C、K450C和S470C取代。20.根據(jù)權(quán)利要求16
?
19中任一項所述的免疫原，其中所述一個或更多個氨基酸取代進一步包含HMPV F第49和436位、第150和470位、第143和477位、第55和442位、第197和439位、第314和421位、第214和257位...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄺達平，G，
申請(專利權(quán))人：美國政府由衛(wèi)生和人類服務(wù)部的部長所代表，
類型：發(fā)明
國別省市：