一種重組尿酸氧化酶聚乙二醇前藥綴合物及其制備方法技術

本發明專利技術涉及生物醫藥領域，具體涉及一種重組尿酸氧化酶聚乙二醇前藥綴合物及其制備方法。該前藥綴合物為重組尿酸氧化酶rUOX與聚乙二醇PEG的前藥綴合物PEG

【技術實現步驟摘要】
一種重組尿酸氧化酶聚乙二醇前藥綴合物及其制備方法


[0001]本專利技術涉及生物醫藥領域，具體涉及一種重組尿酸氧化酶聚乙二醇前藥綴合物及其制備方法，即重組尿酸氧化酶(rUOX)的PEG化的前藥綴合物(PEG
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UOX)，它比可獲得的重組尿酸氧化酶(rUOX)蛋白具有更長的半衰期，可以更少頻率的使用，同時比傳統PEG修飾的尿酸氧化酶減少細胞空泡的產生幾率，可降低引起心血管疾病的潛在風險性。

技術介紹

[0002]尿酸氧化酶(UOX)
[0003]尿酸氧化酶(尿酸氧化還原酶，EC1.7.3.3，Urate Oxidase，Uricase)參與生物體嘌呤代謝過程。嘌呤是機體內重要的生物活性分子，嘌呤核苷酸分解產生的產物黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下產生尿酸，尿酸可進一步分解為尿囊素、尿囊酸、CO2和NH3。尿酸氧化酶將尿酸氧化為尿囊素。人類和一些靈長類動物體內缺乏有活性的尿酸氧化酶，因此尿酸是人類和這些動物嘌呤代謝的最終產物。尿酸溶解度較低，經尿酸氧化酶的作用后成為溶解度更高的尿囊素，使核酸代謝產物更容易排出體外。
[0004]根據2019年《中國高尿酸血癥和痛風診療指南》，目前我國高尿酸血癥患者接近1.7億，患病率達到了13.3％。同時，痛風患者也已超過了1800萬，患病率在1％～3％左右，已成為繼糖尿病之后又一常見代謝性疾病。現有針對高尿酸血癥的藥物普遍存在起效慢、降尿酸不徹底、對肝腎毒副作用大、對體內已經形成的痛風石無效等問題。
[0005]針對高尿酸血癥發病機制，臨床常用藥物可分為抑制尿酸形成和促進尿酸排泄兩類。別嘌醇是臨床一線抑制尿酸形成類藥物，能夠通過抑制XO活性來減少次黃嘌呤和黃嘌呤向尿酸轉化，降低了體內尿酸水平，但臨床研究表明，別嘌醇對高尿酸血癥患者的有效率僅為40％，說明大多數患者發生高尿酸血癥的主要原因并不完全在于尿酸過度產生。長期使用別嘌醇會引起藥疹、發熱、肝腎功能損害、胃腸道反應或超敏反應綜合征。促進尿酸排泄藥物主要包括苯溴馬隆、丙磺舒等，可以通過增加尿量、抑制部分轉運體對尿酸的重吸收降低體內尿酸水平，長期服用苯溴馬隆可引起線粒體功能障礙，產生肝毒性。腎功能不全患者服用丙磺舒降尿酸作用不明顯。由此可見，雖然高尿酸血癥發病機制相對明確，但臨床治療藥物種類較少，特別值得注意的是，臨床通過限制高嘌呤食物攝取，也可以一定程度緩解尿酸的過度產生，因此，促進尿酸排泄藥物的需求大于減少尿酸產生藥物的需求。開發促進尿酸排泄新藥具有較好的臨床應用前景。
[0006]現有針對高尿酸血癥的藥物普遍存在起效慢、降尿酸不徹底、對肝腎毒副作用大、對體內已經形成的痛風石無效等問題。尿酸氧化酶藥物直接分解尿酸成易溶無毒的尿囊素直接排出體外，可快速降低患者體內尿酸水平，且不增加肝腎負擔。聚乙二醇化尿酸氧化酶則在尿酸氧化酶基礎上降低了毒性，延長了藥物體內停留時間，可使患者尿酸水平長期保持在低位。對于慢性或頑固性患者，此類產品優于現有藥物。
[0007]聚乙二醇修飾
[0008]聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一種pH中性，無毒，水溶性較高的親水聚
合物，其重復單元為氧乙烯基，端基為兩個羥基，呈線性或支化鏈狀結構。通過將活化的聚乙二醇用化學方法偶聯到蛋白質、多肽、小分子有機藥物和脂質體等藥物載體上，可改善這些藥物的療效或擴大其應用范圍。
[0009]本領域普遍認為，經聚乙二醇修飾后，大多數蛋白質的性質會發生以下變化：免疫原性與抗原性降低；循環半衰期延長；溶解性增加；耐蛋白酶水解；生物利用度提高；毒性降低；熱穩定性及機械穩定性增加；等電點、電泳行為、動力學性質等改變。另外，很重要的一點是蛋白質經聚乙二醇修飾后會引起細胞學活性降低，主要原因為終產品中引進的基團，包括PEG以及PEG和修飾蛋白質之間的連接鍵所致，也與偶聯的條件、產生的副產物等有關。
[0010]聚乙二醇修飾蛋白質技術已廣泛應用于生物醫藥領域，目前上市的PEG化蛋白藥物中，氨基修飾較為多見。如Roche公司的PEG修飾的干擾素α
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2a、Schering
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Plough公司的PEG修飾的干擾素α
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2b，在血清中清除速度減慢，減少了用藥次數；PEG修飾ADA、PEG修飾G
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CSF，2010年FDA批準上市的治療痛風新藥聚乙二醇化尿酸氧化酶等。這些經修飾后的藥物，被證明半衰期延長，免疫原性減弱，減少了給藥次數，提高了療效大大降低了免疫原性，減小了給藥頻次。
[0011]聚乙二醇化尿酸氧化酶(PEG
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UOX)
[0012]通常情況下，PEG化的尿酸氧化酶可能通過增加其體內半衰期(從而實現劑量減少或給藥頻率降低)、改善其穩定性和降低其抗原性或它們的組合來改善分子特性。
[0013]通常，對分子進行該類型的修飾是本領域眾所周知的并且專利文獻中可獲得很多專利，這些專利描述了這種概念。例如，在專利CN114438047A、CN102260653A、CN102757945A、CN102634492A、CN101928704A、CN101302501A、CN101198693A中，均描述了不同序列尿酸氧化酶蛋白被不同活性基團、不同分子量的聚乙二醇修飾，修飾后的產物是蛋白與PEG進行永久鍵合后形成聚合物
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藥物(PEG
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UOX)結合物，根據文獻顯示，這一類PEG修飾后的蛋白類藥物能誘導細胞內產生功能未知的空泡(Young M A,Malavalli A,Winslow N,et al..Toxicity and hemodynamic effects after single dose administration of MalPEG
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hemoglobin(MP4)in rhesus monkeys.Transl.Res.,2007,149(6):333
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342；Xu J,Bussiere J,Yie J,et al..Polyethylene glycol modified FGF21engineered to maximize potency and minimize vacuole formation.Bioconjug.Chem.,2013,24(6):915
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25.)。目前仍未發現該空泡的相關功能作用，但是心臟大血管上皮細胞內的空泡有可能產生結節，有引起心血管疾病—冠心病的潛在風險(FDA."Center for drug evaluation and research."<http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2010/125293Orig1s000PharmR.pdf>,Cited October 17,2013.)。另外腎小管上皮細胞內空泡的積累會導致腎小管彎曲變形，有導致本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種重組尿酸氧化酶聚乙二醇前藥綴合物，其特征在于，該前藥綴合物為重組尿酸氧化酶rUOX與聚乙二醇PEG的前藥綴合物PEG
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UOX，其中PEG通過自身可水解的且自動裂解的暫時連接子linker與重組尿酸氧化酶rUOX連接，其具有以下結構，其中，n為95～119的正整數，k為8～10之間的正整數。2.根據權利要求1所述的前藥綴合物，其特征在于，所述的重組尿酸氧化酶rUOX是通過基因工程技術獲得的重組尿酸氧化酶，其序列來源于微生物的重組尿酸氧化酶及其突變體；或序列來源于哺乳動物的重組尿酸氧化酶及其突變體；或序列來源于無脊椎動物的重組尿酸氧化酶及其突變體；或序列來源于植物的重組尿酸氧化酶及其突變體。3.根據權利要求2所述的前藥綴合物，其特征在于，所述重組尿酸氧化酶rUOX序列來源于黃曲霉的尿酸氧化酶基因序列。4.如權利要求1所述的前藥綴合物，其特征在于，所述的聚乙二醇為含單一活性功能基團的直鏈單甲氧基聚乙二醇，其中活性功能基團通過自身可水解的且自動裂解的暫時連接子linker與單甲氧基聚乙二醇分子連接，帶有連接子的聚乙二醇分子結構式如下：其中n為75～994的正整數，R為封端基，選自：烷氧基、羥基、氨基、羧基、巰基、酯基、酮基、醛基、鄰二硫吡啶基、疊氮基、酰肼基、炔基、硅烷基、馬來酰亞胺基或琥珀酰亞胺基。5.根據權利要求4所述的前藥綴合物，其特征在于，所述的封端基R為琥珀酰亞胺基，所述的帶有連接子的聚乙二醇分子，結構式如下：其中n為95～119的正整數。6.根據權利要求1所述的前藥綴合物，其特征在于：所述聚乙二醇的平均分子量為4kDa～40kDa。7.如權利要求1
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6任意一項所述前藥綴合物PEG
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UOX的制備方法，其特征在于，包括
如以下步驟：采用純度大于95％的重組尿酸氧化酶蛋白，蛋白終濃度為1
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8mg/ml，采用聚乙二醇的平均分子量為4kDa～40kDa...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉翔，
申請(專利權)人：修正生物醫藥杭州研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：