一種巨噬細胞負載納米復合物抗腫瘤靶向遞藥系統及其制法和應用技術方案

本發明專利技術公開了一種巨噬細胞負載納米復合物抗腫瘤靶向遞藥系統及其制法和應用，所述遞藥系統是將Toll樣受體激動劑、光熱響應劑、磷脂和膽固醇組成脂質體納米粒，將細菌外膜囊泡包覆在載藥脂質體納米粒外表面形成載藥納米復合物，通過共孵育將載藥納米復合物負載于巨噬細胞內而形成；本發明專利技術的系統通過巨噬細胞和脂質體作為載體，結合免疫治療和聯合光療產生光熱效應誘發的免疫原性細胞死亡提高免疫治療效果；經該遞送系統調控后的炎性腫瘤微環境可進一步促進巨噬細胞的招募和蓄積，產生正反饋循環，并有效改善腫瘤免疫抑制微環境、抑制腫瘤生長和轉移。腫瘤生長和轉移。腫瘤生長和轉移。

【技術實現步驟摘要】
一種巨噬細胞負載納米復合物抗腫瘤靶向遞藥系統及其制法和應用


[0001]本專利技術涉及一種靶向遞藥系統，尤其涉及一種巨噬細胞負載納米復合物抗腫瘤靶向遞藥系統，還涉及所述靶向遞藥系統的制法及應用。

技術介紹

[0002]腫瘤微環境(Tumor microenvironment,TME)是腫瘤發生發展的內外環境，并具有復雜的組成成分。TME的細胞成分由腫瘤相關巨噬細胞、樹突細胞、淋巴細胞、成纖維細胞等構成。其中，腫瘤相關巨噬細胞(Tumor
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associated macrophages,TAMs)是TME中最豐富的免疫細胞之一。目前基于巨噬細胞的腫瘤治療策略為抑制巨噬細胞招募、重極化和耗竭巨噬細胞。因M1/M2比例失調是導致腫瘤進展和轉移耐藥的關鍵原因，故通過靶向遞送Toll樣受體(Toll
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like receptors,TLRs)激動劑激活固有免疫NF
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κB信號通路并復極化M2型TAMs是一種極具前景的免疫治療策略，但靶向遞送Toll樣受體激動劑其載藥量有限，仍出現載藥量小和對組織帶來異常變化的安全性的問題。

技術實現思路

[0003]專利技術目的：本專利技術的目的是提供一種載藥量大、強靶向性、安全性強且強效抗腫瘤治療的巨噬細胞負載納米復合物抗腫瘤靶向遞藥系統，第二目的是提供上述遞藥系統的制法及應用。
[0004]技術方案：本專利技術所述遞藥系統包括由Toll樣受體激動劑、光熱響應劑、磷脂和膽固醇組成脂質體納米粒，和在脂質體納米粒外表面包覆細菌外膜囊泡形成載藥的納米復合物，納米復合物共孵育負載于巨噬細胞內而形成。
[0005]優選的，所述Toll樣受體(TLR3、TLR7/8和TLR9)激動劑為聚肌胞苷酸poly(I:C)、咪喹莫特(R837)/瑞喹莫德(R848)、含胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸的寡脫氧核苷酸(CpG ODN)中的一種。
[0006]優選的，所述光熱響應劑為吲哚菁綠(ICG)、碳菁類染料(DIR)、IR820、IR780、鐵酞菁(FePc)、二氯卟吩(Ce6)、卟啉
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二酮吡咯(Por
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DPP)、聚多巴胺(PDA)、金納米粒(AuNPs)、金納米棒(AuNRs)、碳納米管(CNTs)、碳點(CDs)或量子點(QDs)中的一種。
[0007]優選的，所述量子點(QDs)為超微型黑磷量子點(BPQD)。
[0008]優選的，所述細菌外膜囊泡來自于E.coli K
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12W3110、E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α、E.coli JC8031、A.baumannii、K.pneumoniae、P.aeruginosa中的一種。
[0009]優選的，所述巨噬細胞為小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7)、骨髓來源巨噬細胞(BMDM)、腹腔來源巨噬細胞(PM)、外周血來源巨噬細胞或誘導多能干細胞來源巨噬細胞中的一種。
[0010]優選的，所述磷脂為大豆磷脂、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕櫚酰卵磷脂或二硬脂酰卵磷脂中的一種。
[0011]本專利技術所述的巨噬細胞負載納米復合物抗腫瘤靶向遞藥系統的制法，包括如下步驟：
[0012](1)制備負載Toll樣受體激動劑和光熱響應劑的脂質體納米粒：將磷脂、膽固醇和Toll樣受體激動劑溶解于有機溶劑中，旋轉蒸發并室溫干燥，加光熱響應劑水溶液，旋轉水化并超聲分散，水膜過濾后即可得脂質體納米粒。
[0013](2)制備細菌外膜囊泡修飾的載藥納米復合物：制備細菌外膜囊泡水溶液，將脂質體納米粒與細菌外膜囊泡水溶液混合均勻，脂質體擠出儀共擠出后即可得載藥納米復合物。
[0014](3)制備抗腫瘤靶向遞藥系統：將步驟(2)制得的載藥納米復合物用培養基稀釋至適宜濃度后，共孵育后將納米復合物負載在巨噬細胞內即得所述抗腫瘤靶向遞藥系統。
[0015]優選的，步驟(1)中，所述磷脂、膽固醇、Toll樣受體激動劑和光熱響應劑的質量比為180:30:20:1～180:30:20:5；所述Toll樣受體激動劑為咪喹莫特，所述光熱響應劑為超微型黑磷量子點。
[0016]優選的，步驟(2)中，所述細菌外膜囊泡水溶液和脂質體納米粒溶液的體積比為1:1～1:5。
[0017]優選的，步驟(3)中，所述載藥納米復合物中Toll樣受體激動劑的終濃度為5～15μg/mL，共孵育時間為2～12h。
[0018]優選的，步驟(1)具體為：將磷脂、膽固醇和R837溶解于有機溶劑中，在40℃下旋轉蒸發15min除去有機溶劑形成均一油膜，室溫干燥，將BPQD水溶液加入至干燥油膜中，在40℃下旋轉水化30min洗下油膜并使其均勻分散至水溶液中，將該水分散液在一體式超聲波細胞破碎儀的探頭下進一步分散，而后將納米粒溶液依次通過0.45μm和0.22μm的水系微孔濾膜過濾，最終得到負載R837和BPQD的脂質體RB@Lip。
[0019]優選的，步驟(2)具體為：E.coli DH5α細菌培養液在冷凍離心機內于4℃、8000g條件下離心15min棄沉淀，取上清通過0.45μm PES真空過濾器過濾，而后使用100kDa Amicon Ultra15離心超濾管對其進行濃縮棄外管液，取內管液在超速低溫離心機內于4℃、150000g條件下離心2h棄上清，取沉淀在1
×
PBS中重懸經過0.22μm PES真空過濾器過濾，最終得到E.coli DH5α外膜囊泡OMVs。RB@Lip與OMVs以一定的比例經脂質體擠出儀共擠出數次后最終得到E.coli DH5α外膜囊泡修飾的載藥脂質體RB@OL。
[0020]優選的，步驟(3)具體為：1～5
×
106個RAW264.7細胞培養于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，24h后用含RB@OL的無血清DMEM培養基替換，并培養一段時間后使細胞吞噬納米復合物，而后用預熱的PBS緩沖液清洗細胞數次以除去游離的納米復合物，并用細胞刮刀收集細胞最終得到負載納米復合物的巨噬細胞RB
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OL@M。
[0021]本專利技術所述的巨噬細胞負載納米復合物抗腫瘤靶向遞藥系統在制備改善腫瘤免疫抑制微環境和抑制腫瘤生長的藥物中的應用。
[0022]本專利技術采用細菌外膜囊泡修飾的脂質體負載脂溶性的Toll樣受體激動劑和水溶性的光熱響應劑形成載藥納米復合物，接著通過膜融合或內吞進入巨噬細胞，包含在吞噬小體或由融合的吞噬小體和溶酶體形成的吞噬溶酶體中，形成巨噬細胞負載治療性藥物的抗腫瘤靶向遞藥系統。
[0023]其中，采用革蘭氏陰性菌(Gram
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negative,G
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)的外膜囊泡(OMVs)作為載體和免疫激活劑，其粒徑為20
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250nm。與其他外泌體如間充質干細胞衍生的外泌體相比，OMVs更容易被巨噬細胞識本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種巨噬細胞負載納米復合物抗腫瘤靶向遞藥系統，其特征在于，所述遞藥系統包括由Toll樣受體激動劑、光熱響應劑、磷脂和膽固醇組成脂質體納米粒，和在脂質體納米粒外表面包覆細菌外膜囊泡形成載藥的納米復合物，納米復合物共孵育負載于巨噬細胞內而形成。2.根據權利要求1所述的抗腫瘤靶向遞藥系統，其特征在于，所述Toll樣受體激動劑為聚肌胞苷酸、咪喹莫特、瑞喹莫德或含胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸的寡脫氧核苷酸中的一種。3.根據權利要求1所述的抗腫瘤靶向遞藥系統，其特征在于，所述光熱響應劑為吲哚菁綠、碳菁類染料、近紅外染料IR820、近紅外染料IR780、鐵酞菁、二氯卟吩、卟啉
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二酮吡咯、聚多巴胺、金納米粒、金納米棒、碳納米管、碳點或量子點中的一種。4.根據權利要求3所述的抗腫瘤靶向遞藥系統，其特征在于，所述量子點為黑磷量子點。5.根據權利要求1所述的抗腫瘤靶向遞藥系統，其特征在于，所述細菌外膜囊泡來自于大腸桿菌、鮑氏不動桿菌、肺炎克雷伯菌或綠膿桿菌中的一種；所述巨噬細胞為小鼠單核巨噬細胞白血病細胞、骨髓來源巨噬細胞、腹腔來源巨噬細胞、外周血來源巨噬細胞或誘導多能干細胞來源巨噬細胞中的一種；所述磷脂為大豆磷脂、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕櫚酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂中的一種。6.權利要求1所述的巨...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王偉，傅聰，唐璐，
申請(專利權)人：中國藥科大學，
類型：發明
國別省市：