本發明專利技術涉及一種檢測土壤中酸性磷酸單酯酶活性的分析方法：１）稱取鮮土樣品二組２ｎ（ｎ≥３）份置于三角瓶中，向三角瓶中加入甲苯和緩沖溶液，向第一組三角瓶中加入１ｍｌ底物對硝基苯磷酸二鈉溶液，第二組作為樣本對照，搖勻，蓋好瓶塞后恒溫培養；２）培養結束后，向第一組和第二組加堿性三羥基氨基甲烷溶液和氯化鈣溶液終止反應并顯色，并向第二組加入底物溶液，混勻，過濾；３）用分光光度計在４１０ｎｍ處比色測定吸光度值Ａ；４）根據標準曲線計算對硝基苯酚含量，進而計算磷酸單酯酶活性。本發明專利技術優點為：１）簡化了操作步驟，減少了實驗過程中的不確定性；２）減少對設備要求的依賴性；３）方法準確度高，易操作；４）結果穩定可靠，重現性好。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及土壤中磷酸單酯酶活性的測定，具體地說是一種檢測土壤 屮磷酸單酯酶活性的分析方法。技術背景土壤中的磷酸單酯酶能將在土壤磷代謝過程中形成的有機磷酯水解成 正磷酸鹽，參與有機磷的脫磷過程，成為可被微生物和作物利用的有效態。在pH4 — 9的土壤中均有磷酸單酯酶，多以積累態存在。磷酸單酯酶可水解對硝基苯磷酸鹽，通過比色法測定反應后釋放的對 硝基苯酚的含量，來估算磷酸單酯酶的活性。酸性和堿性磷酸酶的活性可 以通過控制反應的pH值來分別測定。對硝基苯磷酸鹽磷酸單酯酶一 對硝基苯酚因此，土壤中磷酸單酯酶活性的強弱影響到土壤磷代謝過程中磷素損 失的大小，間接影響磷肥的利用效率。土壤磷酸單酯酶對土壤磷素的有效 性具有重要作用，可以表征土壤磷酸轉化方向和強度。土壤中磷酸單酯酶 的活性受土壤條件如水分、溫度、土壤質地等的強烈影響，同時也受農田 耕作制度、管理措施以及不同作物的影響。因此，對土壤中磷酸單酯酶活 性的檢驗具有重要的意義。目前有關磷酸單酯酶活性的測定雖然已經形成 一個相對可靠的方法，但仍然具有一定的缺陷，造成不同土壤類型測定的 差異性，以及不同培養批次的差異性和不確定性，難以定性比較和定量研 究土壤中磷酸單酯酶活性，降低了實驗效率。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種土壤中磷酸單酯酶活性的檢測方法。在借鑒 其它酶測定方法原理的基礎上，該方法根據磷酸單酯酶的特性，對其測定 步驟和顯色方法進行改進。該方法減少了試驗步驟的不穩定性，使分析結 果更加精確可靠，分析重現性更好。為實現.t.述目的，本專利技術采用的技術方案為 一種檢測土壤中酸性磷酸單酯酶活性的分析方法， l)分別稱取1 -2&鮮土樣品211份分別置入211個500^三角瓶中，論3， 分成二組，每組n個，向二組2n個三角瓶中加入0.2 -0.4 mi分析純甲苯和 4 -8 ml pll 6.45-6.55緩沖溶液試劑，向第-一組n個三角瓶中加入1 — 2 mL 25 -50 m moL. L—'的底物對硝基苯磷酸二鈉工作液，以第二組n個三角瓶中作 為樣本對照，混勻，蓋好瓶塞，放在36.5 -37.5T:恒溫培養箱中恒溫培養1-2 h:2) 培養結束后，向所有三角瓶中加入4 -8 mL 0.09 - O.llmoL' L' pH 11.5-12.5的堿性三羥基氨基甲烷溶液和1 -2mL 0.25-0.5 moL' L"氯化鈣溶 液，向樣木對照組n個三角瓶中添加1 -2 mL 25 -50 m moL' L—1的底物對硝 基苯磷酸二鈉工作液，混勻，過濾；試驗中加入的堿性緩沖液溶液是用來終止酶促反應，抑制磷酸單酯到 磷酸的反應，且不會產生強堿對土壤有機質的分解作用而對產物測定產生 顏色千擾，同時避免在一定時間內產生沉淀而影響測定。3) 用分光光度法于410 nm處分別測定上述所得三角瓶中溶液的吸光度A;以對硝基苯酚溶液標準溶液，以對硝基苯酚溶液的系列濃度和其分別 用分光光度法在410nm測定的吸光值A'制作工作標準曲線，得到斜率b;根據吸光值A和斜率b，計算所測定濾液中對硝基苯酷的濃度S， S=A*b;計算樣品中對硝基苯酚含量m,;4) 計算磷酸單酯酶酶活性計算公式為w=mi/ (m2xK) 3嗎(:61"151\1〇3'^干土'11-| 式中W:單位土壤單位吋間內對硝基苯酚的產生量；ml:測試溶液中 對硝基苯酚的質量，樣品測定吸光值折換的產物質量值；m2:鮮土樣品質 量；k:水分系數，單位重量的烘干土重/鮮土重。當步驟3)中的待測液顏色明顯超過制作標準曲線最高濃度吋溶液的顏色，表明其中對硝基苯酚含量過高，則用原緩沖溶液稀釋5-10倍后再進行比色，若顏色還是過深(目測比對制作標準曲線最高濃度時的溶液顏色)，則重復上述稀釋過程；最終再用分光光度法于410 nm處測定溶液的吸光度 A。所述制作工作標準曲線過程為稱取IOOO mg對硝基苯酚溶解于l L 蒸餾水中，制備標準貯備液；吸取標準貯備液lmL，定容到100mL，此為 0.01 mg mL"對硝基苯酚的溶液；再分別吸取該液0、 1、 2、 3、 4、 5 mL 于試管中，用蒸餾水補足到相同體積5 mL，加入4 mL 0.1 moL， L—1堿性 THAM (三羥基氨基甲烷)緩沖溶液和1 mL 0.5 moL. L—1氯化鈣溶液，顯色、 混勻，過濾到比色試管中，與樣品一起在410nm測定吸光度A，； 此標準 系列含對硝基苯酚的的濃度分別為0、 1、 2， 3、 4和5 (ig 'mL"(量為0， 10， 20， 30、 40和50嗎)，以對硝基苯酚溶液的系列濃度和測定的吸光值 A'制作工作標準曲線，得到斜率b。所述堿性THAM緩沖溶液的配制過程為稱取12.2 g三羥甲基氨基甲 烷(THAM)于800 mL蒸餾水中，用0.5 mol L"的NaOH調節pH至12.0， 用蒸餾水定容到1000 mL。本專利技術方法改進的依據土壤中的磷酸單酯酶是參與土壤中e—甘油磷酸酯、苯磷酸酯、P—萘磷酸酯、硝基苯磷酸酯等的水解的一類酶的總稱，在測定過程中分解底物 對硝基苯磷酸二鈉生成對硝基苯酚，需要加入氫氧化鈉和氯化鈣終止反應 并顯色。 一定濃度的氫氧化鈉加入土壤溶液中會造成土壤有機質分解，生 成產物呈褐色，在一定程度上影響比色結果。本試驗中添加堿性三羥基氨 基甲垸溶液即可避免土壤有機質分解，減少顏色干擾，同吋避免在測定過 程中產生大量碳酸鈣沉淀而影響測定的穩定和準確。 本專利技術所使用的測定原理為土壤中的磷酸單酯酶能夠水解對硝基苯磷酸鹽，通過比色法測定反應后 釋放的對硝基苯酚的含量，來估計磷酸單酯酶的活性。本試驗擬通過反應 后對硝基苯酚C6H5N〇3的生成量來表征土壤磷酸單酯酶活性。酸性和堿性 磷酸酶的活性通過控制反應的pH值來分別測定。測定酸性磷酸酶活性時，溶液的pH值為6.5。與其它酶的分析方法相比較，本專利技術的優點主要有1) 所需設備簡單、降低了試驗成本。本專利技術中的培養試驗是在50 mL 的三角瓶中進行，培養結朿后直接過濾到15ml試管中。2) 所使用的方法顯色簡單，提高了樣品測定的準確度。3) 操作簡單，減少操作過程的復雜性；分析結果穩定可靠，重現性好。 該酶的其它測定方法中需要設置滅菌土壤作為對照，本方法只需要不加底 物的樣品對照。同時，由于本專利技術所涉及到的顯色步驟減少了土壤有機質 堿解形成的顏色以及顯色步驟產生的碳酸鈣沉淀對測定結果的影響而導致 不確定性，故分析結果重現性非常良好。具體實施方式 試劑配制1) 對硝基苯磷酸二鈉溶液(0.05mol.L—稱取0.9303 g六水對硝基 苯磷酸二鈉溶于40 mL pH 6.5的緩沖溶液，然后用同一種緩沖溶液稀釋至 50mL，低溫貯存備用。2) 緩沖溶液(pH6.5):稱取12.1g三(羥甲基)氨基甲烷、11.6 g丁 烯二酸、14.0 g檸檬酸和6.3 g硼酸于488 mL氫氧化鈉溶液[C (NaOH)= lmol丄力中，然后用水稀釋到1L，低溫貯存備用；取出200mL上述溶液 至1000mL燒杯中，用鹽酸(O.lmol'L")溶液調至pH6.5。3) 甲苯，分析純。4) 0.5 mol ' L一1 CaCl2溶液稱取73.5 gCaCl2.2H本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測土壤中酸性磷酸單酯酶活性的分析方法，其特征在于：?。保┓謩e稱?。保玻珲r土樣品２ｎ份分別置入２ｎ個三角瓶中，ｎ≥３，分成二組，每組ｎ個，向二組２ｎ個三角瓶中加入０．２－０．４ｍｌ分析純甲苯和４－８ｍｌ?。穑龋叮矗担叮担稻彌_溶 液試劑，向第一組ｎ個三角瓶中加入１－２ｍＬ ２５－５０ｍ?。恚铮?Ｌ↑［－１］的底物對硝基苯磷酸二鈉工作液，以第二組ｎ個三角瓶中作為樣本對照，混勻，蓋好瓶塞，放在３６．５－３７．５℃恒溫培養中恒溫培養１－２ｈ； ２）培養結束后，向所有三角 瓶中加入４－８ｍＬ ０．９５－０．１５ｍｏＬ.Ｌ↑［－１］ｐＨ＝１１．５－１２．５的堿性三羥基氨基甲烷溶液和１－２ｍＬ?。埃玻担埃担恚铮?Ｌ↑［－１］氯化鈣溶液，向樣本對照組ｎ個三角瓶中添加１－２ｍＬ?。玻担担埃怼。恚铮?Ｌ↑［－１］的底物對硝基苯磷酸二鈉工作液，混勻，過濾； ３）用分光光度法于４１０ｎｍ處分別測定上述所得三角瓶中溶液的吸光度Ａ； 以對硝基苯酚溶液標準溶液，以對硝基苯酚溶液的系列濃度和其分別用分光光度法在４１０ｎｍ測定的吸光值Ａ’制作工作標準曲 線，得到斜率ｂ； 根據吸光值Ａ和斜率ｂ，計算所測定濾液中對硝基苯酚的濃度Ｓ，Ｓ＝Ａ＊ｂ；計算樣品中對硝基苯酚含量ｍ↓［１］；?。矗┯嬎懔姿釂熙ッ该富钚裕骸∮嬎愎綖椋海鳎剑怼郏保荩ǎ怼郏玻荨粒耍剑应蹋纭。谩郏叮荩取? ５］ＮＯ↓［３］.ｇ↑［－１］干土.ｈ↑［－１］ 式中：ｗ：單位土壤單位時間內對硝基苯酚的產生量；ｍ↓［１］：測試溶液中對硝基苯酚的質量，樣品測定吸光值折換的產物質量值；ｍ↓［２］：鮮土樣品質量；ｋ：水分系數，單位重量的烘干土重／鮮土 重。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張玉蘭，武志杰，陳利軍，陳振華，
申請(專利權)人：中國科學院沈陽應用生態研究所，
類型：發明
國別省市：89[中國|沈陽]
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