一種用于流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的快速熒光PCR檢測試劑盒制造技術

本發明專利技術公開了一種同時檢測流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的雙重熒光PCR檢測方法及其用途。本發明專利技術提供用于流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌檢測的特異性引物和探針，并建立了流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的雙重熒光PCR檢測方法。本發明專利技術的特異性引物探針和檢測方法特異性強、靈敏度高、重復性和穩定性好，為流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的鑒別診斷提供了快速、敏感、特異的臨床檢測方法。特異的臨床檢測方法。

【技術實現步驟摘要】
一種用于流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的快速熒光PCR檢測試劑盒


[0001]本專利技術涉及一種同時檢測流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的雙重熒光PCR檢測試劑盒，本專利技術提供用于流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌檢測的特異性引物和探針，并建立了流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的雙重熒光PCR檢測方法。本專利技術的特異性引物探針和檢測方法特異性強、靈敏度高、重復性和穩定性好，為流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的檢測、鑒別與診斷提供了快速、敏感、特異的臨床檢測方法，屬于體外診斷領域。

技術介紹

[0002]在全球范圍內肺炎仍然是一種常見的威脅兒童健康的嚴重感染性疾病，目前5歲以下兒童的死亡原因中肺炎最多，約占18%，且死亡患兒中大部分是嬰幼兒(約75%)。該病給發展中國家造成了巨大的醫療經濟負擔。一直以來，我國社區獲得性肺炎感染的病原菌以細菌為主。據統計流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌是我國社區獲得性肺炎感染的常見病原菌。大多數情況下，肺炎克雷伯菌還是新生兒敗血癥排在前三位的致病因素之一。因此快捷準確鑒定的檢測并鑒定病患是否感染流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌，對臨床診治和用藥具有重大意義。
[0003]肺炎克雷伯菌最早在19世紀末被分離出來，最初被稱為弗里德蘭氏菌，它是一種無動力且含有莢膜的革蘭氏陰性菌，存在于土壤、地表水以及醫療設備的環境中。該菌在正常人的口咽部的檢出率達1%
?
6%，在住院患者中的檢出率則可高達20%，常感染具有基礎疾病的患者，包括酒精中毒者，患糖尿病者或者患慢性阻塞性肺疾病者。肺炎克雷伯菌作為社區獲得性感染和醫院獲得性感染的重要病原體，現已經成為排在大腸桿菌后頭的第二大條件致病菌。肺炎克雷伯菌存在于人體 腸道與上呼吸道咽部，一旦機體免疫力降低，病原菌即可經呼吸道直接進入肺部引起感染，常見于肺部上葉，可導致腹炎、泌尿系統炎癥、敗血癥等疾病。
[0004]流感嗜血桿菌是嗜血桿菌屬中對人有致病性的最常見細菌。該菌寄生于人體上呼吸道，屬條件致病菌，當機體抵抗力低下或免疫系統不健全時，即可引起感染，是兒童社區獲得性感染的重要病原菌，也是兒童嚴重細菌感染的主要病原菌之一，能引起肺炎、化膿性扁桃體炎、會厭炎、中耳炎等感染性疾病，還可引起腦膜炎、敗血癥等侵襲性感染，嚴重威脅兒童的健康。在我國，流感嗜血桿菌是引起兒童呼吸道感染的重要病原菌。
[0005]目前，以實時熒光定量PCR技術為基礎的核酸診斷方法是國內應用最為廣泛的方法之一，該方法的原理主要基于標記不同顏色Taq
?
Man熒光探針。現有的核酸檢測試劑盒大多采用單重探針方法實現靶基因的快速診斷。本專利技術采用雙重熒光定量PCR技術，在同一反應體系中加入2條不同顏色標記的熒光探針，可以實現在一管反應中同時檢測2個靶基因的目的，能夠同時檢測流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌，通量高，檢測速度快。在肺炎診斷和治療等方面具有重要的應用前景。

技術實現思路

[0006]本專利技術的目的在于提供一種同時檢測流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的雙重熒光PCR檢測試劑盒及使用方法，快速準確地檢測樣品中是否存在流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌，提供一種特異性檢測流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的雙重熒光PCR試劑盒。
[0007]組分包括PCR反應液、酶混合液、陰性質控品和陽性質控品。其中PCR反應液主要含有上述的2種細菌的引物和探針、反應緩沖液、Mg
2+
和dNTP等，酶混合液主要含有熱啟動Taq酶，陰性質控品為無RNase和DNase水，陽性質控品為含有流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌檢測靶序列的重組質粒。
[0008]PCR反應液中用于核酸擴增的引物為P1和P2，P1和P2為針對流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌基因組群特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物；PCR反應液中用于熒光信號監測的寡核苷酸探針為Probe1，Probe1為針對流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌基因組群特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性探針具體引物序列（見表1）。
[0009]表1 引物和探針序列試劑盒選用的PCR反應體系為20
?μ
l，包括2
×
PCR緩沖液10
?μ
l、10mmol/L dNTP 1.0
?μ
l、熱啟動Taq酶混合液0.4
?μ
l、混合引物0.5
μ
l、樣品DNA 2
μ
l，加滅菌水至終體系20
?μ
l。
[0010]試劑盒的PCR反應循環參數為94℃，2min；進入循環階段：94℃變性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反應40個循環。
[0011]質量控制：每次實驗應設立陰、陽性對照，陰性對照無Ct值（或Ct值為0），陽性對照Ct值≤30，否則實驗結果不成立。
[0012]結果判讀：陽性：出現“S”型擴增曲線，Ct值≤35；可疑：出現“S”型擴增曲線，但Ct值＞35；陰性：沒有出現“S”型擴增曲線，或者曲線雖然超過了閾值，但不呈“S”型；對可疑結果，應重復實驗，如果重復實驗還是出現“S”型擴增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性。
[0013]樣本要求：臨床樣本類型包括咽拭子、痰液和細菌培養物；臨床樣本采集后應帶冰運輸，
?
20℃保存，不能反復凍融；從臨床樣本提取DNA，建議采用性能穩定可靠的商品化試劑盒，具體方法參見相應商品化試劑盒說明書，提取的DNA應立即檢測，否則，應將DNA分裝后
?
80℃～
?
20℃保存。
[0014]本專利技術提供的試劑盒具有很好的特異性，可以檢出流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌，但不能檢出非流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌病原體的核酸；對流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌核酸的檢測下限為10拷貝每反應體系；只需要2小時即可完成檢測，可為肺炎致病病原
體的監測和臨床診斷提供實驗依據。
附圖說明
[0015]圖1為實時熒光PCR檢測流感嗜血桿菌陽性標準品的擴增曲線圖，圖2為實時熒光PCR檢測肺炎克雷伯菌陽性標準品的擴增曲線圖。從左至右的每組曲線對應濃度依次為2
×
106?2×
102copies/μl，試劑盒對流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的檢測限為10拷貝每反應體系。橫坐標為反應循環數，縱坐標為不同循環數熒光檢測信號的ΔRn值。
[0016]圖3為雙重實時熒光PCR檢測體系檢測10種細菌基因組DNA的擴增曲線圖。10種細菌包括：流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌和8種陰性對照微生物。肺炎克雷伯菌和流感嗜血桿菌出現S型擴增曲線，而其他8種病原微生物未出現S型擴增曲線。
具體實施方式
[0017]下面結合具體實施例詳細說明本專利技術的優選實施方式。需要指出的是，這里列出的實施例僅僅為示例性說明的目的，而不應將其解釋為對本專利技術范圍的任何限制。其中使用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實施例中具體選擇的試劑，應理解，本領域技術人員可根據需要選擇其他公司的相應試劑以實現本專利技術的目的。<本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種同時檢測他流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的引物探針組合，其特征在于，包括流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的檢測引物探針，具體引物探針序列如下：流感嗜血桿菌：SEQ NO.1上游引物P1：5`
?
ATATGCCGATGGTGTTGGCCCAGG
?
3`SEQ NO.2下游引物P2：5`
?
ATCCTTACACCGTGCGTAAAGA
?
3`SEQ NO.3探針Probe 1：5`
?
FAM
?
CGTTGGTAAAAGAACTTGCA
?
MGB
?
3`肺炎克雷伯菌：SEQ NO.4上游引物P1：5`
?
CAGACCGAAGAAGTCGGTGTT
?
3`SEQ NO.5下游引物P2：5`
?
AGAGGAATCGCCGCCGAAT
?
3`SEQ NO.6探針Probe 1：5`
?
CY5
??
ACGAAGGCCGTGAAGC
?
MGB
?
3`。2.一種同時檢測他流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的雙重熒光PCR檢測方法，其特征在于，利用權利要求1所述的引物探針混合物對流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌同時進行檢測；流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌上游引物、下游引物和探針MIX配比，流感嗜血桿菌引物探針MIX，上游引物P1：下游引物P2：探針Probe1=0 .032～0.128：0 .032～0.128：0 .012～0.08；肺炎克雷伯菌引物探針MIX，上游引物P1：下游引物P2：探針Probe1=0 .032～0.128：0 .032～0.128：0 .012～0.08；0 .012～0.08。3.根據權利要求2所述的雙重熒光PCR檢測方法...

【專利技術屬性】
技術研發人員：丁小靜，
申請(專利權)人：江蘇和創生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：