本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乳糖診斷／測定試劑（盒），同時(shí)本發(fā)明專利技術(shù)還涉及測定乳糖濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)／食品檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)的試劑（盒）主要成分包括：緩沖液、輔酶、乳糖酶、半乳糖氧化酶、ＮＡＤ（Ｐ）氧化酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外／可見光分析儀下，檢測主波長３４０ｎｍ處吸光度上升的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種乳糖診斷/測定試劑(盒)，同時(shí)本專利技術(shù)還涉及測定乳糖濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測定
技術(shù)介紹
乳糖是嬰幼兒主要的能量來源，進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)小腸乳糖酶作用分解成葡萄糖和半 乳糖，半乳糖是嬰幼兒腦發(fā)育的必需物質(zhì)，與嬰幼兒大腦的迅速成長有密切聯(lián)系。為防止乳 清粉中摻加用其他還原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的檢測十分必要。 牛奶是一種營養(yǎng)豐富的食品，但如飲用不當(dāng)，也會給健康帶來不良影B向。很多人在 飲奶后出現(xiàn)腹部不適、腹脹、多屁、腹痛甚至腹瀉等癥狀，這種現(xiàn)象在醫(yī)學(xué)上稱為乳糖不耐 受癥，其原因是這些人小腸缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖進(jìn)入結(jié)腸后，經(jīng)結(jié)腸 中的細(xì)菌發(fā)酵，產(chǎn)生大量氣體、醋酸等物質(zhì)所致。大量研究證實(shí)，患有乳糖不耐受的人還有 大部分沒有任何癥狀、只有人體生化指標(biāo)改變的隱性不耐受者，醫(yī)學(xué)上稱為乳糖吸收不良 或乳糖酶缺乏。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界都存在乳糖不耐受的問題，其中亞洲人發(fā)生率最高，為 95%-100%。據(jù)中國疾病控制中心調(diào)查，我國北京、上海、廣州等地3_13歲兒童乳糖不耐受 癥和乳糖吸收不良的發(fā)生率約為80%。乳糖不耐受除引起消化道癥狀外，還可造成人體營 養(yǎng)吸收不良。據(jù)國外研究，乳糖不耐受可減少鈣的攝入、減少峰值骨量、增加骨丟失從而引 發(fā)骨質(zhì)疏松癥，乳糖不耐受可影響鐵和鋅的吸收，造成鐵缺乏和鋅缺乏，并可影響小兒的腦 發(fā)育，對人體健康危害很大。 在食品分析領(lǐng)域中，酶分析法是廣為使用并倍受諸如ISO等國際標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)推薦的 一種方法。酶析法理論發(fā)展成熟并且已為實(shí)驗(yàn)室普遍接受。使用高質(zhì)量經(jīng)純化的酶可以實(shí) 現(xiàn)對復(fù)雜物質(zhì)中特定成份的檢測。該方法可以檢測的目標(biāo)代謝物有糖類、酸類及其鹽類、醇 類和其他物質(zhì)等。由此，各種食品樣品均可被快速檢測并獲得良好的結(jié)果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定乳糖濃度的方法，同時(shí)，本專利技術(shù)還將給出用以實(shí)現(xiàn) 該方法的乳糖診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀上進(jìn)行乳糖濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推 廣應(yīng)用。 本專利技術(shù)乳糖濃度測定方法如下 乳糖+水乳糖酶半乳糖+葡萄糖 半乳糖+氧半乳糖氧化酶半乳糖己糖雙醛糖+過氧化氫 過氧化氫+輔酶NAD (P) H氧化酶還原型輔酶+氧 這種方法應(yīng)用乳糖酶(lactase ;EC 3. 2. 1. 108)酶(偶)聯(lián)半乳糖氧化酶 (galactoseOxidase ;EC 1. 1. 3. 9) 、NAD(P)氧化酶(NAD(P)H oxidase ;EC 1. 6. 3. 1)酶促反應(yīng)比色終點(diǎn)法。乳糖酶酶解乳糖反應(yīng)產(chǎn)生半乳糖，再通過(偶)聯(lián)合半乳糖氧化酶、NAD(P) 氧化酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處 有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸 光度上升的程度，可以測算乳糖的濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本專利技術(shù)乳糖診斷/測定試劑(盒)較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3mmol/L 乳糖酶 10000U/L 半乳糖氧化酶 12000U/L NAD(P)氧化酶 12000U/L 本專利技術(shù)的乳糖診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乳糖酶、半乳糖氧化酶、NAD(P)氧化酶。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖酶、半乳糖氧化酶、NAD(P)氧化酶。 輔酶、乳糖酶、半乳糖氧化酶、NAD(P)氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、半乳糖氧化酶、NAD(P)氧化酶。 試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、乳糖酶。 輔酶、乳糖酶、半乳糖氧化酶、NAD(P)氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可 以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本專利技術(shù)測定乳糖濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例子對本專利技術(shù)作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一 本實(shí)施例的乳糖診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3,1/L 乳糖酶 10000U/L 半乳糖氧化酶 12000U/L NAD(P)氧化酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. l，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乳糖樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的乳糖診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 輔酶 3mmol/L 試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 乳糖酶 10000U/L 半乳糖氧化酶 12000U/L NAD(P)氧化酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. l，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乳糖樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。 實(shí)施例三 本實(shí)施例的乳糖診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑輔酶試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑半乳糖氧化酶 NAD(P)氧化酶 試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 乳糖酶50mmol/L 3mmol/L100,1/L 500,1/L 12000U/L 12000U/L100,1/L 500,1/L 10000U/L試劑全部溶解配好后本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種酶比色法及酶聯(lián)法的乳糖的濃度測定方法，其方法如下： 乳糖＋水 乳糖酶 半乳糖＋葡萄糖 半乳糖＋氧 半乳糖氧化酶 半乳糖己糖雙醛糖＋過氧化氫 過氧化氫＋輔酶 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ氧化酶 還原型輔酶＋氧 將最終反應(yīng)物置于紫外／可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長３４０ｎｍ吸光度上升的程度，測算出乳糖的濃度大小測定結(jié)果。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王爾中，
申請(專利權(quán))人：蘇州艾杰生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：32[中國|江蘇]
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