抗凝血藥物的生物學活性檢測方法技術

本公開涉及抗凝血藥物的生物學活性檢測方法。具體而言，本公開涉及一種抗FXI/FXIa抗體生物學活性檢測方法，該方法用酶標儀替代傳統方法的凝血儀對抗FXI/FXIa抗體生物學活性進行分析，并且簡化了實驗操作，縮短了實驗周期，提高了檢測效率。提高了檢測效率。

【技術實現步驟摘要】
抗凝血藥物的生物學活性檢測方法


[0001]本公開涉及到抗體藥物的生物學活性檢測領域，更具體地說涉及抗凝血因子XI(Factor XI，FXI)或其活化形式XIa(Factor XIa，FXIa)的抗體及其抗原結合片段的體外生物學活性檢測方法。

技術介紹

[0002]血栓性疾病不僅發病率高，而且致死率和致殘率也很高?？鼓幬锸怯行Х乐窝ㄐ约膊〉乃幬?。凝血級聯反應是系列凝血因子相繼被激活，最終形成纖維蛋白的過程。凝血級聯反應由內源途徑(又稱為接觸激活途徑)和外源途徑(又稱組織因子途徑)啟動，再經共同途徑生成纖維蛋白。FXI是維持內源途徑所必需的，并且在凝血級聯反應放大過程中發揮關鍵作用。因此針對FXI靶點的藥物，可阻斷內源途徑，抑制凝血級聯反應的放大，從而起到抗血栓形成的作用。
[0003]體內高水平的凝血因子XI與血栓形成事件相關，抗FXI/FXIa抗體是一種有效預防或治療血栓形成的藥物，其通過結合血液中的凝血因子XI或其活化形式XIa阻止內源性凝血途徑，從而達到抗凝血的目的。作為對抗體藥物有效性的質量評價或質量控制的方法之一，對抗FXI/FXIa單克隆抗體的體外生物學活性進行測定具有重要意義。
[0004]抗FXI/FXIa抗體生物學活性測定通常采用活化部分凝血活酶時間(aPTT)法。aPTT法通常使用凝血儀測定系列濃度抗體的凝血時間，繪制抗體濃度與凝血時間的曲線，進而計算供試品的生物學活性。用凝血儀測定抗體生物活性需要對系列濃度的樣品及對照品分批測定，往往測定一個樣品用時較長，對于8通道凝血儀大需要2小時，而且大多數生物藥分析實驗室不具備凝血儀，而酶標儀是實驗室常用儀器。本公開中，我們使用酶標儀代替凝血儀，根據系列濃度抗體在相同作用時間凝血的不同程度，測定透射光OD值。當血漿沒有凝固時，透射光OD值最?。划斞獫{完全凝固時，透射光OD值達到最大；當血漿在凝固過程中時，在一定范圍內透射光OD值與凝血時間成線性相關(R2>0.99，參見附圖1、2)。因此凝血過程的OD值可以反映血漿凝固的程度。通過測定在一定反應時間下抗體系列濃度的凝血OD值，繪制抗體系列濃度與OD值的量效反應曲線，該曲線反映了抗FXI/FXIa抗體的抗凝血作用，通過與標準品(或對照品)的比較，從而可計算抗FXI/FXIa抗體供試品的生物學活性。酶標儀法測定一個樣品(含對照品)大只需要20分鐘，較凝血儀法大大縮短了時間，對于樣品數量較多時，前者優勢更加顯著。
[0005]本公開的目的在于提供一種抗FXI/FXIa抗體生物學活性檢測方法，該方法用酶標儀替代傳統方法的凝血儀對抗FXI/FXIa抗體生物學活性進行分析，并且簡化了實驗操作，縮短了實驗周期，提高了檢測效率。

技術實現思路

[0006]本公開涉及一種操作時間短、準確性高、重復性好的抗FXI/FXIa抗體的活性檢測方法。
[0007]本公開提供一種抗凝血藥物的活性檢測方法，該方法包括以下的步驟：
[0008](a)將供試品和對照品用緩沖液按比例稀釋成系列濃度；
[0009](b)加入血漿，孵育；
[0010](c)加入aPTT試劑，孵育；
[0011](d)加入CaCl2；和
[0012](e)于酶標儀上讀取OD值，根據檢測數據計算供試品的相對生物學活性。
[0013]一些實施方案中，上述抗凝血藥物為抗體，例如為抗FXI/FXIa抗體、抗FXII/FXIIa抗體、抗FIX抗體、抗FX抗體、抗FVII抗體、抗FVIII抗體、抗血小板糖蛋白IIb/IIIa受體抗體。
[0014]一些實施方案中，上述供試品和對照品為抗凝血藥物，例如為抗FXI/FXIa抗體、抗FXII/FXIIa抗體、抗FIX抗體、抗FX抗體、抗FVII抗體、抗FVIII抗體、抗血小板糖蛋白IIb/IIIa受體抗體、肝素、阿斯匹林、水蛭素、秋水仙堿、替羅非班、西洛他唑、噻氯吡啶。
[0015]在一些實施方案中，所述供試品和對照品為相同的抗凝血藥物，例如相同的抗FXI/FXIa抗體。
[0016]在一些實施方案中，所述活性檢測方法還進一步包含步驟(f)加入EDTA溶液，終止反應，所述在步驟(f)位于(d)和(e)步驟之間。
[0017]在一些實施方案中，進一步地，所述步驟(f)中的EDTA溶液的濃度為約15mM至約50mM，例如約15mM至約45mM、約15mM至約40mM、約15mM至約35mM、約15mM至約30mM、約15mM至約25mM、約20mM至約50mM、約20mM至約45mM、約20mM至約35mM、約20mM至約30mM、約17mM至約27mM、約25mM至約30mM、約25mM至約35mM。在一些非限制性實施方案中，所述步驟(f)中的EDTA溶液的濃度為約15mM、約20mM、約21mM、約22mM、約23mM、約24mM、約25mM、約26mM、約27mM、約28mM、約29mM、約30mM、約40mM或約50mM。在一些實施方案中，進一步地，所述步驟(f)中的EDTA溶液的濃度為約25mM。
[0018]在一些實施方案中，如上任一項所述的活性檢測方法，其中所述步驟(a)中的緩沖液為Tris
?
HCl緩沖液。
[0019]在一些實施方案中，如上任一項所述的活性檢測方法，其中所述步驟(a)中的緩沖液濃度為約20mM至約100mM，例如約20mM至約90mM、約30mM至約80mM、約40mM至約70mM、約45mM至約60mM、約50mM至約55mM、約25mM至約95mM、約35mM至約85mM、約45mM至約75mM、約55mM至約65mM、約20mM至約70mM、約20mM至約50mM、約30mM至約60mM、約40mM至約60mM、約45mM至約55mM。在一些非限制性實施方案中，其中所述步驟(a)中的緩沖液濃度為20mM、約30mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM或約100mM。在一些實施方案中，如上任一項所述的活性檢測方法，其中所述步驟(a)中的緩沖液濃度為約50mM。
[0020]在一些實施方案中，如上任一項所述的活性檢測方法，其中所述步驟(a)中的緩沖液的pH值為約6.0至約8.5，例如約6.0至約8.0、約6.0至約7.5、約6.5至約8.5、約6.5至約8.0、約6.5至約7.5、約7.0至約8.0、約7.0至約7.5、約7.0至約7.4、約7.2至約7.4(7.3
±
0.1)。在一些非限制性實施方案中，所述步驟(a)中的緩沖液的pH值為約6.0、約6.5、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、約8.0、約8.5。在一些實施方案中，如上任一項所述的活性檢測方法，其中所述步驟(a)中的緩沖液的pH值為7.3
±
0.1。
[0021]在一些實施方案中，如上任一項所述的活性檢測方法，其中所述步驟(a)中的緩沖液可本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種抗凝血藥物的生物學活性檢測方法，包括以下的步驟：(a)將供試品和對照品用緩沖液按比例稀釋成系列濃度；(b)加入血漿，孵育；(c)加入aPTT試劑，孵育；(d)加入CaCl2溶液；和(e)于酶標儀上讀取OD值，根據檢測數據計算供試品的相對生物學活性；其中，所述供試品和對照品為同一種抗凝血藥物。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性檢測方法還進一步包含步驟(f)加入EDTA溶液，終止反應，所述步驟(f)位于(d)和(e)步驟之間；優選地，所述EDTA溶液的濃度為約15mM至約50mM，更優選地，所述EDTA溶液的濃度為約25mM。3.根據權利要求1
?
2中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中的緩沖液的pH值為6.0至8.5，優選7.3
±
0.1。4.根據權利要求1
?
3中任一項所述的方法，所述步驟(a)中的緩沖液為Tris
?
HCl緩沖液；優選地，所述Tris
?
HCl緩沖液的濃度為約20mM至約100mM；更優選地，所述Tris
?
HCl緩沖液的濃度為約50mM；和/或，所述步驟(a)中的緩沖液可以含有有色物質，并且所述有色物質不影響抗體與抗原的反應以及凝血過程；優選地，所述有色物質為臺盼藍；優選地，所述有色物質含量為約0.001％至約0.005％，更優選約0.002％；和/或，所述步驟(a)中的稀釋比例選自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128。5.根據權利要求1
?
4中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)和(c)中的孵育條件為約20℃至約37℃，約500rpm至約1000rpm轉速，孵育1min至30min；優選地，所述步驟(b)中的孵育條件為約25℃
±
2℃、約1000rpm轉速下孵育10min；優選地，所述步驟(c)中的孵育條件為約25℃
±
2℃、約1000rpm轉速下孵育3min；和/或，所述步驟(d)中的CaCl2為溶液，濃度為約1mM至約30mM，優選為約12.5mM；和/或，所述步驟(e)中的OD值是在340
±
20nm處60秒至180秒讀取獲得，優選為340nm處60
?
90秒。6.根據權利要求1
?
5中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(e)中的供試品的相對生物學活性是通過將檢測數據進行四參數方程擬合，分別計算出供試品和對照品的EC
50
值，再根據對照品EC
50
值與供試品EC
50
值的比值計算出供試品的相對生物學活性。7.根據權利要求1
?
6中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗凝血藥物為抗體；優選地，所述抗體選自抗FXI/FXIa抗體、抗FXII/FXIIa抗體、抗FIX抗體、抗FX抗體、抗FVII抗體、抗FVIII抗體、抗血小板糖蛋白IIb/IIIa受體抗體。更優選地，所述抗體為抗FXI/FXIa抗體；更優選地，所述抗FXI/FXIa抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：所述重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：7、8、9所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和所述輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：10、11、12所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。8.根據權利要求1
?
7中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗FXI/FXIa抗體包含抗體
重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，所述重鏈可變區和輕鏈可變區選自：重鏈可變區序列如SEQ ID NO：5或與之具有至少90％同一性的序列，輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：6或與之具有至少90％同一性的序列；重鏈可變區序列如SEQ ID NO：13或與之具有至少90％同一性的序列，輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：14或與之具有至少90％同一性的序列；重鏈可變區序...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉偉旭，黃黎明，向春霞，侯維花，湯辰翔，
申請(專利權)人：上海邁晉生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：