油菜雄性不育細胞質NAU5A的育種方法技術

本發明專利技術公開了一種甘藍型油菜雄性不育細胞質ＮＡＵ５Ａ的創建方法和特征，屬于遺傳工程領域和植物育種領域。利用甘藍型油菜原生質體技術，獲得了融合后代，從融合后代中發現了不育株；利用ＮＡＵ５Ｂ保持系與該不育株雜交和回交，得到了穩定不育系ＮＡＵ５Ａ。提取ＮＡＵ５Ａ不育系的線粒體ＤＮＡ，并且利用ＰＣＲ技術克隆鑒定不育胞質，得到ＮＡＵ５Ａ不育系的線粒體ＤＮＡ的一個特征序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１和其編碼氨基酸序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２。本發明專利技術的細胞質和特征基因序列為首次報導。ＮＡＵ５Ａ細胞質可廣泛應用十字花科植物的雜種優勢利用，具有很好的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術公開了一種甘藍型油菜細胞質及其特征線粒體DNA序列，屬于遺傳工程領域和植物育種領域。具體地講，涉及十字花科植物的雜種優勢利用，為十字花科植物雜交種選育提供新型不育細胞質細胞質。
技術介紹
細胞質雄性不育可以應用于雜交種生產，效益巨大，已經為人們普遍認可。細胞質雄性不育系用于配置雜交種，可提高油菜菜籽產量15%以上，也可可顯著提高十字花科蔬菜的產量。目前，在油菜乃至十字花科植物中，主要應用細胞質雄性不育主要是polimaCMS、陜2A 、 OguCMS (參見劉平武等，甘藍型油菜pol CMS育性恢復基因的分子標記中國油料作物學報，2007， 29 (1): 14—19.)。polima CMS是傅廷棟教授于1972年在甘藍型油菜品種波里馬中發現19株天然細胞質雄性不育株，后將穩定下來的不育系稱polima CMS(簡稱pol CMS)，其恢復基因位于A組染色體上，為一對顯性基因。PolCMS不育性也受溫度的影響，依其保持系細胞核基因的不同，可分為高溫不育、低溫不育和穩定不育3種類型。通過篩選，獲得缺乏溫度敏感基因的保持系，可育成不育性穩定的polcms系。pol CMS目前的應用面最廣。陜2ACMS是李殿榮(1980)于1976年在甘藍型油菜品種間復交組合(574-3/(豐收4號+7207混合授粉)]后代中發現的半不育株，后經連續回交轉育得到穩定不育系陜2A,其恢復基因為l對顯性基因。陜2A與poICMS具有共同的保持系和恢復系，由其配制的三系雜種"秦油2號"是國際上第一個通過品種審定、并大面積用于生產的甘藍型三系雜交種。Ogu CMS是由0gura(1968)在日本蘿卜Raphanus sativas L.群體中發現天然雄性不育，選育得到的系統。法國Bannerol等(1977)采用連續回交的方法將這種胞質分別轉育到甘藍型油菜和甘藍中，得到油菜蘿卜質雄性不育系。oguCMS不育性穩定，所有甘藍型油菜品種均是它的保持系，其恢復基因存在于歐洲的蘿卜品種中。OguCMS生產的雜交油菜已經在英、法等國商品化生產。目前，全世界已經報導的油菜不育細胞質有22種以上，但是應用較多的細胞質主要是POLCMS。目前油菜CMS利用中還是存在一些問題，主要是①油菜CMS育性不穩定問題；②應用的CMS細胞質比較單一，讓人不禁想起單一細胞質可能造成的生產損失。因此，發掘新的油菜CMS系統仍然具有十分重要的意義。我們在油菜原生質體融合后代中，發現不育株，通過雜交和回交，獲得了 NAU5A 型細胞質雄性不育系；鑒定分子線粒體DNA，證明NAU5A不育系是由線粒體重組 得到的新型不育系。
技術實現思路
技術問題本專利技術的目的在于公開一種細胞質雄性不育NAU5A，該不育胞質是通 過原生質體融合后代選育而得到的。油菜及十字花科雜種優勢利用中，存在不育細 胞質單一，育性不穩定等問題，本專利技術的細胞質雄性不育為解決細胞質單一問題提 供了新手段，可用于油菜及其十字花科雜種優勢利用。技術方案上述NAU5A雄性不存細胞質，屬于新型細胞質雄性不育類型，可用于甘藍型油菜、 白菜等十字花科植物的雜種優勢利用。通過雜交、回交等育種方式，育成NAU5A細 胞質的雄性不育系。TGA該序列編碼的重組蛋白序列(SEQIDNo.2)為:FR有益效果1、 本專利技術的目的在于公開一種細胞質雄性不育NAU5A，該不育胞質是通過原生 質體融合后代選育而得到的。2、 油菜及十字花科雜種優勢利用中，存在不育細胞質單一，育性不穩定等問題。 本專利技術人提供的細胞質是經過線粒體基因組重組而獲得的，該重組類型不同于 已經大面積應用了20年的POLIMA不育胞質類型(pol)，該不育胞質的應用將有利于解決不育細胞質單一的問題。而且該細胞質雄性不育類型的不育性比較 徹底，易于培育徹底穩定不育系。3、 本專利技術人提供的不育胞質是線粒體基因組重組的結果利用具有NAP型胞質 的可育親本原生質體融合，獲得融合雜種；由于遺傳的異質性，導致線粒體DNA 重組，從而可得到的不育胞質。線粒體DNA的分子實驗證明了這個結論。本發 明的細胞質雄性不育不同于NAP型細胞質雄性不育，NAP型細胞質的恢復系是 NAU5A的保持系；也不同于POLIMA型細胞質雄性不育系，POLIMA型不育 系的線粒體編碼ORF224蛋白，導致雄性不育，而本專利技術的不育胞質編碼重組 型ORF222R5蛋白。從利用的角度看，NAP細胞質的利用價值不大，而本專利技術 的NAU5A細胞質利用價值很大。4、 本專利技術人提供的不育胞質可以通過種間雜交，轉移到白菜、甘藍等十字花科物 種中去，為這些十字花科物種的雜種優勢利用，提供細胞質雄性不育，因此應 用可以很廣泛。5、 研究中，通過基因表達分析，發現NAU5A的重組型基因Oi F222^在穩定不 育系中表達大，而在可育雜交組合中該重組型基因表達量低，說明該基因與雄 性不育的形成有關。具體實施例方式實施例1以播娘蒿(D"cwraZw'a"w; /n'a)葉片和甘藍型油菜(5raw'ca rta;ws)子葉為 材料提取原生質體，采用PEG"高pH、高鈣附加DMSO融合方法，液體淺層靜 置培養，研究影響播娘蒿與甘藍型油菜原生質體融合的因素，獲得了 19株再生植 株。結果表明4%纖維素酶+ 0.5 %離析酶+5 mmol/L MES酶解10h和1 %纖維 素酶+ 0.2%離析酶+3 mmol/L MES酶解14h分別適合獲得高產率播娘蒿與油菜 原生質體；30%PEG + 0.3mol/L葡萄糖+ 50 mmol/L CaC12 2H20 + 15%DMSO 獲得了 10%的融合率；改良B5培養基的原生質體培養效果較好；每次添加不同 的新鮮培養基和添加MES對于防止褐化具有很好的效果；適宜分化培養基為MS + 4.0 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA + 5.0mg/L AgN03;適宜生根培養基為MS + 0.1 mg/L IB A + 0.1 mg/L NAA 。甘藍型油菜與播娘蒿的原生質體融合獲得的再生植株移栽到田間后，對其進 行了形態學、細胞學及花粉活力觀察。雜種植株生長緩慢、在葉型、葉片缺刻、 葉緣裂痕、莖桿分枝處顏色、花蕾初期顏色等形態學上表現出播娘蒿的特征，開 花期和成熟期相對較晚；雜種植株花比油菜花小，花粉活力低，結實率低。在融 合雜種中出現了 7個不育株，用甘藍型油菜與融合雜種進行雜交和回交研究。實施例2利用原生質體融合技術所獲得的融合雜種中，出現了不育株。用不育株了與 NAU5B雜交，進一步從雜交F1開始選擇徹底不育株與NAU5A回交，經過5代回 交，得到穩定的不育系NAU5A。 NAU5A的不育性在年份間表現穩定不育。通過測 交，已經找到恢復系，實現了三系配套，為雜種優勢利用提供了新的授粉控制系統。 研究開創了細胞質方法，通過該方法從融合雜種至回交一代，均發現細胞質重組； 基因克隆的研究表明，回交一代以后細胞質mtDNA保持穩定，不再發生重組。NAU5A是通過原生質體融合獲得的一系列重組細胞質的中的一個。本專利技術中， 選育不育胞質的方法體系中，結合了mtDNA重組方法以及和育種選擇方法，最后 通過細胞質鑒定，得到了優良的不育細胞質。實施例3利用NAU5A不育胞質本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種細胞質雄性不育胞質ＮＡＵ５Ａ：利用原生質體融合技術，通過雜交和回交育種方法，得到甘藍型油菜細胞質雄性不育系和保持系，分別命名為ＮＡＵ５Ａ和ＮＡＵ５Ｂ。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：管榮展，姜淑慧，田琳琳，張紅生，杜同慶，陳健美，鄭秀，張麗君，張鳳啟，
申請(專利權)人：南京農業大學，
類型：發明
國別省市：84[]