一種重組蛋白及其制備方法和在牛結核病檢測中的應用技術

本發明專利技術涉及生物技術領域，提出了一種重組蛋白及其制備方法和在牛結核病檢測中的應用，所述重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，編碼所述重組蛋白的基因的核苷酸序列如如SEQ ID NO.2所示。所述重組蛋白由ESAT

【技術實現步驟摘要】
一種重組蛋白及其制備方法和在牛結核病檢測中的應用


[0001]本專利技術涉及生物
，具體的，涉及一種重組蛋白及其制備方法和在牛結核病檢測中的應用。

技術介紹

[0002]牛結核病是由分支桿菌屬牛分支桿菌引起的一種慢性疾病，以組織器官的結核結節性肉芽腫和干酪樣、鈣化的壞死病灶為特征，具有劇烈傳染性，我國將其列為二類動物疫病。19世紀后期，科赫設計了著名的結核菌素皮膚試驗，是目前被世界動物衛生組織認可的檢測牛結核病的手段，在我國廣泛用于牛結核病的診斷和流行病學調查，但經典的PPD（結合菌素）因所含抗原成分復雜導致特異性較差，大多數抗原為分枝桿菌屬所共有，與環境分枝桿菌存在交叉反應，容易導致假陽性檢測結果。其次，結核菌素作為結核分枝桿菌次級產物，生產周期至少需要6個月，且培養結核分枝桿菌需體外多次傳代，可能產生菌失活、基因缺失、遺傳背景不清楚等現象，導致不同批次結核菌素檢測效力不均一，這些因素都可能影響結核菌素皮膚試驗的檢測結果。
[0003]隨著時代的進步，結核菌素的生產工藝不斷優化，增加了產量的同時也保證了產品的穩定性，但結核菌素的本質沒有變，其中依然含有200多種抗原，導致其診斷的特異性較差，大多數抗原為卡介苗所共有，不能夠區分出是自然感染牛還是卡介苗接種牛，從而嚴重干擾牛結核病陽性結果的判定，而卡介苗在世界范圍內廣泛接種，這一舉措會干擾了結核菌素皮膚試驗的檢測，導致檢查出假陽性的動物被淘汰，對養殖戶造成嚴重的經濟損失。
[0004]結核菌素至今已有近百年的歷史，隨著對結核病的不斷深入，天然CFP10和ESAT6蛋白具有較強的細胞免疫活性。有文獻報道ESAT
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6、CFP
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10具有高度保守性，并加強了這兩種抗原在牛結核病診斷中的應用。其次，研究發現這兩種蛋白均能誘發遲發性變態反應，具有較好的診斷潛力。更重要的是，ESAT6和CFP10基因在卡介苗基因中缺失，使用這兩種蛋白可以區分結核分支桿菌感染還是卡介苗株感染，在體外診斷中具有較高的特異性，與結核菌素相比特異性高達93%，但靈敏度只有73%，導致ESAT6
?
CFP10重組蛋白（即EC）檢測牛結核病的效果不理想。
[0005]目前，國內也有發現用EC法進行的檢測產品，即重慶智飛生物的“宜卡”，應用的是重組蛋白ESAT6
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CFP10，用于人的結核分枝桿菌感染的檢測。此產品將結核分枝桿菌早期分泌性低分子量蛋白ESAT6和CFP10融合在一起，通過原核表達系統表達了重組蛋白ESAT6
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CFP10。此產品只是表達了重組蛋白ESAT6
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CFP10，但未解決其靈敏度低的問題，ESAT
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6和CFP
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10兩種蛋白對牛結核病的檢測效果依舊次于結核菌素。

技術實現思路

[0006]本專利技術提出一種重組蛋白及其制備方法和在牛結核病檢測中的應用，解決了現有技術中EC法檢測牛結核病時靈敏度低的問題。
[0007]本專利技術的技術方案如下：
本專利技術提出了一種重組蛋白，所述重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本專利技術還提出了一種編碼所述重組蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]作為進一步的技術方案，所述重組蛋白包括串聯組合的ESAT
?
6、CFP
?
10和BFH。
[0010]作為進一步的技術方案，所述ESAT
?
6的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CFP
?
10的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述BFH的氨基酸序列SEQ ID NO.5所示。
[0011]作為進一步的技術方案，所述ESAT
?
6、CFP
?
10和BFH用Linker按照ESAT
?6?
CFP
?
10
?
BFH的方式串聯組合，所述Linker的氨基酸序列SEQ ID NO.6所示。
[0012]本專利技術還提出了所述重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：（1）分別將ESAT
?
6、CFP
?
10和BFH的氨基酸序列進行密碼子優化；（2）用Linker按照ESAT
?6?
CFP
?
10
?
BFH的方式將優化后的ESAT
?
6、CFP
?
10和BFH串聯組合，得到合成基因EC
?
BFH；（3）將合成基因EC
?
BFH插入原核表達載體pET 28a，得到EC
?
BFH表達載體；（4）將EC
?
BFH表達載體轉入蛋白表達菌株，表達、純化后得到重組蛋白。
[0013]作為進一步的技術方案，所述蛋白表達菌株為BL21（DE3）大腸桿菌菌株。
[0014]作為進一步的技術方案，所述純化時采用尿素變性和復性。
[0015]作為進一步的技術方案，所述尿素變形和復性包括以下步驟：（1）菌體破碎及蛋白變性：將表達后得到的菌體用含尿素的結合緩沖液重懸，用細胞破碎儀超聲破碎菌體，離心，收集上清液；（2）蛋白純化：采用親和層析法進行蛋白純化：將上清液與填料孵育5
?
20min后，用洗滌緩沖液洗滌除去雜蛋白，用洗脫緩沖液將蛋白洗脫；（3）蛋白復性：采用透析法將洗脫液中的尿素透析除去，得到重組蛋白。
[0016]作為進一步的技術方案，所述結合緩沖液的配方為：20 mM PB，200 mM NaCl，10 mM咪唑，尿素2~6 M，溶液pH7.4；所述洗滌緩沖液的配方為：20 mM PB，200 mM NaCl，150 mM咪唑，尿素2~6 M，溶液pH7.4；所述洗脫緩沖液的配方為20 mM PB，200 mM NaCl，400 mM咪唑，尿素2~6 M，溶液pH7.4。
[0017]作為進一步的技術方案，采用透析法將洗脫液中的尿素透析除去的具體操作為：先依次用處理液1和處理液2處理透析袋，然后將洗脫液轉移至透析袋內，放入復性液中透析。
[0018]作為進一步的技術方案，所述處理液1的配方為：2％碳酸氫鈉、1 mM EDTA，溶液pH8.0；所述處理液2的配方為：10 mM EDTA，溶液pH8.0；所述復性液的配方為：20 mM PB，其中0.1M PB的配方為：為77.4 mL 1M Na2HPO4，22.6 mL 1M NaH2PO4，去離子水定容至1L，溶液pH7.4。
[0019]本專利技術還提出了所述重組蛋白在制備檢測或診斷牛結核病試劑中的應用。
[0020]作為進一步的技術方案，所述檢測或診斷牛結核病試劑包括所述重組蛋白，還包括低分子量透明質酸。
[0021]本專利技術還提出了所述重組蛋白在制備牛結核病檢測試劑盒中的應用。<本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種重組蛋白，其特征在于，所述重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根據權利要求1所述的一種重組蛋白，其特征在于，所述重組蛋白包括串聯組合的ESAT
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6、CFP
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10和BFH。3. 根據權利要求2所述的一種重組蛋白，其特征在于，所述ESAT
?
6的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CFP
?
10的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述BFH的氨基酸序列SEQ ID NO.5所示。4. 根據權利要求2所述的一種重組蛋白，其特征在于，所述ESAT
?
6、CFP
?
10和BFH用Linker按照ESAT
?6?
CFP
?
10
?
BFH的方式串聯組合，所述Linker的氨基酸序列SEQ ID NO.6所示。5. 一種編碼權利要求1所述重組蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。6.權利要求1
?
4任意一項所述重組蛋...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊中興，鄭可，鮑佳鵬，周紅霞，陳彪，王翠然，張玲玲，劉夢珂，李彥芬，王振華，
申請(專利權)人：河北新世紀藥業有限公司，
類型：發明
國別省市：