本發(fā)明專利技術(shù)屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能夠抑制結(jié)直腸癌增殖的蛋白或基因抑制劑。本發(fā)明專利技術(shù)發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO.1所示蛋白或其編碼基因能抗結(jié)直腸癌。能抗結(jié)直腸癌。能抗結(jié)直腸癌。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
抗結(jié)直腸癌的蛋白及其基因片段
[0001]本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)學(xué)
，具體涉及一種能夠抑制結(jié)直腸癌增殖的蛋白或基因抑制劑。
技術(shù)介紹
[0002]細(xì)胞骨架蛋白4.1N蛋白可由EBP41家族的中EPB41L1基因片段對應(yīng)表達(dá)，4.1N蛋白含有膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域MBD、血影蛋白
?
肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域CTD等。目前尚無實驗揭示4.1N蛋白片段(或等價的基因片段形式，如EPB41L1的MBD基因片段)可否用于抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。
技術(shù)實現(xiàn)思路
[0003]本專利技術(shù)克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過反復(fù)篩選，提供了一種能夠抑制結(jié)直腸癌增殖的蛋白或基因抑制劑，發(fā)現(xiàn)4.1N蛋白MBD區(qū)能抗結(jié)腸癌。
附圖說明
[0004]圖1為4.1N不同功能結(jié)構(gòu)域蛋白的過表達(dá)對RKO細(xì)胞增殖的影響。
具體實施方式
[0005]實驗方法：
[0006]1.Western blot檢測結(jié)腸癌細(xì)胞系中4.1N蛋白的表達(dá)
[0007]Western blot檢測具有不同分化和轉(zhuǎn)移能力的結(jié)腸癌細(xì)胞系中4.1N蛋白的表達(dá)。收集細(xì)胞后，通過蛋白質(zhì)裂解緩沖液(蛋白酶抑制劑，PMSF)裂解。BCA法測定蛋白含量后，使用SDS Loading Buffer調(diào)整蛋白濃度，于100℃煮沸10min，使用10％SDS
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PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜置于含5％脫脂牛奶的TBST中37℃封閉1h，一抗(兔抗人GAPDH，Abcam；兔抗人4.1N，Abcam)4℃過夜孵育，TBST洗三次后，二抗(HRP山羊抗兔，Abcam)室溫孵育1h，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Thermo Fisher)進(jìn)行顯影。
[0008]2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和蛋白表達(dá)定位
[0009]RKO細(xì)胞以5
×
105個/mL鋪于六孔板中，轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)基更換為無血清無雙抗的培養(yǎng)基，使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)分別轉(zhuǎn)染pEGFP和pEGFP
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4.1N質(zhì)粒：在525μL無血清無雙抗培養(yǎng)基中加入9μg質(zhì)粒(pEGFP、pEGFP
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4.1N)，混合均勻；在450μL無血清無雙抗培養(yǎng)基中加入22.5μLLipofectamine 2000，混合均勻，靜置5min；將上述兩種混合液各取450μL混合均勻，室溫靜置20min，緩慢加入培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染6h后更換含有10％FBS的完全培養(yǎng)基。48h后，使用熒光顯微鏡觀察RKO細(xì)胞中蛋白的表達(dá)和定位情況。
[0010]3.4.1N不同功能結(jié)構(gòu)域蛋白的過表達(dá)對RKO細(xì)胞增殖的影響
[0011]RKO細(xì)胞轉(zhuǎn)染包含4.1N蛋白不同功能結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒pEGFP
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HP，EGFP
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MBD，pEGFP
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U2，pEGFP
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SABD，GFP
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U3，GFP
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CTD以及pEGFP
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C3質(zhì)粒48h后，胰酶消化后收集細(xì)胞，將RKO細(xì)
胞以3
×
104個/mL在96孔板中培養(yǎng)12h，每組設(shè)置5個復(fù)孔，每孔加入10μL CCK
?
8試劑，置于37℃孵育2h后，酶標(biāo)儀檢測450nm處的OD值，間隔24h檢測一組，共檢測7d。細(xì)胞增殖能力計算公式：細(xì)胞增殖能力＝[(實驗組OD
?
空白組OD)/(對照組OD
?
空白組OD)]×
100％，實驗組：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的RKO細(xì)胞；對照組：RKO細(xì)胞；空白組：CCK
?
8工作液。
[0012]本實驗使用的EPB41L1的MBD結(jié)構(gòu)域基因，序列為：
[0013]1gccatctgcc gggtcactct gcttgatgcc tcggagtatg agtgtgaggt ggagaaacat
[0014]61ggccggggcc aggtgctgtt tgacctggtc tgtgaacacc tcaacctcct agagaaggac
[0015]121tacttcggcc tgaccttctg tgatgctgac agccagaaga actggctgga cccctccaag
[0016]181 gagatcaaga agcagatccg gagtagcccc tggaattttg ccttcacagt caagttctac
[0017]241 ccgcctgatc ctgcccagct gacagaagac atcacaagat actacctgtg cctgcagctg
[0018]301 cgggcagaca tcatcacggg ccggctgcca tgctcctttg tcacgcatgc cctactgggc
[0019]361 tcctacgctg tgcaggctga gctgggtgac tatgatgctg aggagcatgt gggcaactat
[0020]421 gtcagcgagc tccgcttcgc ccctaaccag acccgggagc tggaggagag gatcatggag
[0021]481 ctgcataaga catatagggg gatgaccccg ggagaagcag aaatccactt cttagagaat
[0022]541 gccaagaagc tttccatgta cggagtagac ctgcaccatg ccaaggactc tgagggcatc
[0023]601 gacatcatgt taggcgtttg tgccaatggc ctgctcatct accgggaccg gctgagaatc
[0024]661 aaccgctttg cctggcccaa gatcctcaag atctcctaca agaggagtaa cttctatatc
[0025]721 aagatccggc ctggggagta tgagcaattt gagagcacaa ttggctttaa gctcccaaac
[0026]781 caccggtcag ccaagagact gtggaaggtc tgcatcgagc atcatacatt cttccggctg
[0027]841 gtgtcc
[0028]對應(yīng)表達(dá)的4.1N蛋白的蛋白片段MBD(簡稱4.1N
?
MBD蛋白)，序列如SEQ ID NO.1所示,具體為：
[0029]AICRVTLLDA SEYECEVEKH GRGQVLFDLV CEHLNLLEKD YFGLTFCDAD SQKNWLDPSK
[0030]EIKKQIRSSP WNFAFTVKFY PPDPAQLTED ITRYYLCLQL RADIITGRLP CSFVTHALLG...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
1.蛋白或其編碼基因在制備抗結(jié)直腸癌藥中的應(yīng)用，所述蛋白...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：康巧珍，周楊，劉鑫，王小龍，劉嬌嬌，汲振余，魯吉珂，王婷，伊娟娟，
申請(專利權(quán))人：河南省銀豐生物工程技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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