使用血小板裂解物制備樹突狀細胞的方法技術

本發明專利技術提供使用血小板裂解物，由單核細胞制備樹突狀細胞的方法。本發明專利技術的由單核細胞制備具有細胞毒性的樹突狀細胞的方法包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】使用血小板裂解物制備樹突狀細胞的方法


[0001]本專利技術涉及一種由單核細胞制備樹突狀細胞的方法。

技術介紹

[0002]已知樹突狀細胞(Dendritic cell：DC)是生物體內強大的抗原提呈細胞，其通過向T細胞提呈抗原來誘導免疫應答。另外，已知DC不僅直接作用于T細胞，還直接作用于B細胞、NK細胞、NKT細胞等，是在免疫反應中起中樞性作用的細胞。未成熟DC受到抗原刺激，由此隨著CD40、CD80、CD86等表達上調而獲得很強的刺激T細胞能力，同時轉移到外周淋巴組織，通過活化對內吞的抗原具有特異性的T細胞來誘導免疫應答。
[0003]作為已認可能夠從血液前驅細胞誘導樹突狀細胞分化的物質，一般已知有多種細胞因子。例如，有很多關于通過GM
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CSF與IL
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4同時使用來誘導DC分化的報告(非專利文獻1)。此外，也報告有能夠通過單獨使用或與其他細胞因子同時使用來分化誘導DC的物質(非專利文獻2)，例如報告有TNF
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α、IL
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2、IL
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3、IL
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6、IL
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7、IL
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12、IL
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13、IL
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15、HGF(Hepatocyte growth factor，肝細胞生長因子)、CD40配體、M
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CSF、Flt3配體、C
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kit配體、TGF
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β等。
[0004]在同時使用GM
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CSF與IL
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4來誘導分化DC的方法中，是通過貼壁培養法進行的，將單個核細胞(單核細胞與淋巴細胞)接種到培養皿中，洗滌淋巴細胞，將貼壁的單核細胞用于培養。在GM
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CSF/IL
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4存在下培養5～7天，通過培養基的洗滌操作、刮削(物理性剝取)來回收細胞，更換成含有佐劑(免疫增強劑)OK432的培養基(新鮮培養基)，制作成熟的DC。
[0005]另外，還報告有使用G
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CSF制備樹突狀細胞的方法(專利文獻1)和通過使用IFN的非貼壁培養制備樹突狀細胞的方法(專利文獻2)。
[0006]現有技術文獻
[0007]專利文獻
[0008]專利文獻1：國際公布第WO2014/126250號
[0009]專利文獻2：國際公布第WO2016/148179號
[0010]非專利文獻
[0011]非專利文獻1：Akagawa K.S.et al.,Blood,Vol.88,No.10(November 15),1996：pp.4029
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4039
[0012]非專利文獻2：O
’
Neill D.W.,et a.,Blood,Vol.104,No.8(October 15),2004：pp.2235
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2246

技術實現思路

[0013]專利技術所要解決的問題
[0014]本專利技術的目的在于提供使用血小板裂解物，由單核細胞制備樹突狀細胞的方法。
[0015]用于解決問題的技術方案
[0016]一直以來，雖然報告有由外周血中的單核細胞制備樹突狀細胞(DC)的方法，但是
以往的方法中，DC的收率不足。另外，為了將DC用于癌癥治療，需要DC除了強大的抗原提呈能力及吞噬能力以外還具有細胞毒性等活性。
[0017]本專利技術人等為了提高DC的收率、制作功能性高的DC而進行了潛心研究。結果發現，使用血小板裂解物(HPL)、GM
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CSF和PEG化干擾素α(PEG
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IFN
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α)，進而從外周血分離出單核細胞，然后通過非貼壁培養即懸浮培養來制作DC，由此能夠在短時間內制作優化的DC，提高制作DC的收率，從而獲得的DC也具有強大的細胞毒性，直至完成了本專利技術。
[0018]即，本專利技術如下。
[0019][1]一種由單核細胞制備具有細胞毒性的樹突狀細胞的方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM
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CSF和PEG化干擾素α的無血清培養基，通過非貼壁培養對從外周血中分離的單核細胞進行培養，然后添加前列腺素E2和OK432，進一步通過非貼壁培養進行培養。
[0020][2]根據[1]所述的由單核細胞制備樹突狀細胞的方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM
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CSF和PEG化干擾素α的無血清培養基，通過非貼壁培養進行2～5天的培養后，添加前列腺素E2和OK432，進一步進行1～2天的培養。
[0021][3]根據[1]或[2]所述的由單核細胞制備樹突狀細胞的方法，其中，使用含有1(v/v)％～10(v/v)％的人血小板裂解物(HPL)、100U/mL～10,000U/mL的GM
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CSF、500ng/mL～5μg/mL的PEG化干擾素α、5ng/mL～50ng/mL的前列腺素E2和5μg/mL～50μg/mL的OK432的無血清培養基，對單核細胞進行培養。
[0022][4]根據[1]～[3]中任一項所述的由單核細胞制備樹突狀細胞的方法，其中，無血清培養基為DCO
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K。
[0023][5]根據[1]～[4]中任一項所述的由單核細胞制備樹突狀細胞的方法，其中，獲得的樹突狀細胞的活細胞率為90％以上，獲得的樹突狀細胞數相對于培養時的單核細胞數的比例即收率為15％以上。
[0024][6]根據[1]～[5]中任一項所述的由單核細胞制備樹突狀細胞的方法，其中，獲得的樹突狀細胞為CD14、CD16、CD56、CD83、CD86、CCR7(CD197)、HLA
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ABC、HLA
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DR陽性。
[0025][7]一種樹突狀細胞，其是通過[1]～[6]中任一項所述的由單核細胞制備樹突狀細胞的方法獲得的。
[0026][8]一種藥物組合物，其含有[7]所述的樹突狀細胞。
[0027][9]根據[8]所述的藥物組合物，其具有抗癌免疫活性，能夠用于癌癥治療。
[0028][10]一種單核細胞的分離方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)的無血清培養基，在貼壁培養容器中對外周血單個核細胞進行15分鐘～3小時的培養，除去非貼壁細胞，回收貼壁細胞。
[0029][11]根據[10]所述的單核細胞的分離方法，其使用含有1(v/v)％～10(v/v)％的人血小板裂解物(HPL)的無血清培養基。
[0030][12]根據[10]或[11]所述的單核細胞的分離方法，其中，無血清培養基為DCO
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K。
[0031][13]一種單核細胞來源的細胞毒性樹突狀細胞的分化誘導劑，其含有人血小板裂解物(HPL)、GM
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CSF、本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.一種由單核細胞制備具有細胞毒性的樹突狀細胞的方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM
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CSF和PEG化干擾素α的無血清培養基，通過非貼壁培養對從外周血中分離的單核細胞進行培養，然后添加前列腺素E2和OK432，進一步通過非貼壁培養進行培養。2.根據權利要求1所述的由單核細胞制備樹突狀細胞的方法，其包括：使用含有人血小板裂解物(HPL)、GM
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CSF和PEG化干擾素α的無血清培養基，通過非貼壁培養進行2～5天的培養后，添加前列腺素E2和OK432，進一步進行1～2天的培養。3.根據權利要求1或2所述的由單核細胞制備樹突狀細胞的方法，其中，使用含有1(v/v)％～10(v/v)％的人血小板裂解物(HPL)、100U/mL～10,000U/mL的GM
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CSF、500ng/mL～5μg/mL的PEG化干擾素α、5ng/mL～50ng/mL的前列腺素E2和5μg/mL～50μg/mL的OK432的無血清培養基，對單核細胞進行培養。4.根據權利要求1～3中任一項所述的由單核細胞制備樹突狀細胞的方法，其中，無血清培養基為DCO
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K。5.根據權利要求1～4中任一項所述的由單核細胞制備樹突狀細胞的方法，其中，獲得的樹突狀細胞的活細胞率為90％以上，獲得的樹突狀細胞數相對于培養時的單核細胞數的比例即收率為15％...

【專利技術屬性】
技術研發人員：下平滋隆，小屋照繼，坂本卓彌，硎美紗，
申請(專利權)人：學校法人金澤醫科大學，
類型：發明
國別省市：