本發明專利技術屬生物醫藥領域。公開一種檢測甲羥孕酮的直接競爭酶聯免疫測定試劑盒。本發明專利技術提供甲羥孕酮抗原合成方案，首先用甲羥孕酮合成甲羥孕酮－３－羧甲基肟，后者在碳二亞胺催化下，用Ｎ－羥基丁二酰亞胺活化，與牛血清白蛋白結合，合成免疫原；與辣根過氧化物酶結合，合成酶標抗原。用免疫原，免疫新西蘭大白兔，獲得甲羥孕酮多抗。測定時，用羊抗兔多抗（二抗）包被酶標板，二抗與甲羥孕酮多抗結合，洗滌后加入樣品或甲羥孕酮標準和酶標抗原，顯色測定，就可得出結果。本發明專利技術試劑盒中配制的各試劑，使用方便。這為食品安全，藥物檢測中，甲羥孕酮的檢測，提供一個快速，特異，靈敏和準確的檢測方法。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬生物醫藥
，藥物檢測，食品安全檢測試劑。具體而言，本專利技術利用免疫反應的高靈敏性和特異性，以及酶促反應的放大效應和易檢測性，建立 起來的一種檢測甲羥孕酮的直接競爭酶聯免疫測定試劑盒
技術介紹
醋酸甲羥孕酮(Medroxyprogesterone acetate, MPA)是一種人工合成 的孕酮衍生物，又稱安宮黃體酮，其孕激素活性為孕酮的10 30倍。與之類似的孕酮衍生 物尚有甲地孕酮(Megestrol acetate)，氯地孕酮(Chlormadinineacetate)等，該類化合 物統稱為乙酰化的促孕劑。醫學上用來避孕，治療痛經，功能性閉經，先兆流產等。在養殖 業上，該類化合物有加速動物生長，增加飼料利用率的作用，故曾作為飼料添加劑。但甲羥 孕酮等易在動物體內貯留，人食用有這類化合物殘留的食品，有引起性功能紊亂，肝腎功能 損害，甚至于誘發腫瘤等潛在性危害。故世界各國都明文禁止在飼料中添加該類物質。我 國也將甲羥孕酮作為"食品動物飼料中禁用的獸藥及化合物"。 現今有關甲羥孕酮的檢測方法，多采用氣相色譜_質譜聯用(GC-MS)，液相色 譜-質譜聯用(LC-MS)或多級聯用技術如LC-MS-MS，其設備要求高，技術難度大，對技術人 員要求也高。本專利技術利用酶聯免疫測定原理，定量檢測動物組織，糞便，膽汁.尿液中的甲 羥孕酮殘留，是一種不需要昂貴的儀器投入， 一般中等文化水平的人員，經過短期培訓，就 可掌握的檢測方法。該試劑盒檢測多種樣品中的甲羥孕酮，為食品中和臨床醫學中甲羥孕 酮檢測，提供了一種高效，快速，特異的檢測方法。 專利技術內容本專利技術提供一種快速檢測甲羥孕酮的酶聯免疫試劑盒。其制備的甲羥 孕酮試劑盒，線性范圍為0. lng/ml 20ng/ml， IC5。為1. 9ng/ml左右，靈敏度為0. 08ng/ml 。 穩定期在6個月以上(4t:冰箱保存)。 本專利技術公開免疫原的合成，動物的免疫，特異性抗體的制備，試劑盒的調試和裝 配，試劑盒各種參數的確定及樣品的前處理和測定方法。 甲羥孕酮，化學名17P-羥-19-去甲基-雄甾-4-烯-3_酮。縮寫為MPA，分子 量274. 4，為小分子物質，不具有免疫原性而僅具有免疫反應性，生產甲羥孕酮的酶聯免疫 測定試劑盒，必須要制備對甲羥孕酮有高度特異性的抗體。 要獲得對甲羥孕酮有高度特異性的抗體，首要條件是要有一個能激發動物產生抗 體的抗原。因此，免疫原的制備最為重要。其解決的方案是甲羥孕酮共價連接上一個大分 子物質，通常是與一種蛋白質交聯。常用的有牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲狀腺球蛋白，大鑰 匙孔狀槭血藍蛋白等，本專利技術公開一種制備甲羥孕酮免疫原的方法。首先用一羥胺化合物， 羧甲基羥胺，修飾MPA，生成甲羥孕酮-3-羧甲基肟(MPA-3-CM0)，后者與N-羥基丁二酰亞 胺反應，用二環己碳二亞胺(DCC)或水溶性碳二亞胺{1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二 亞胺；1-環己-3-(2-瑪啉-4-乙基)碳二亞胺對甲基苯亞磺酸鹽}催化，使之活化，然后 與載體蛋白分子中游離胺基相連，生成甲羥孕酮免疫原。 有了免疫原，第二步就是用免疫原免疫動物，本專利技術是免疫l. 5 2kg大小的新西 蘭雌性家兔，獲得對甲羥孕酮有特異性反應的多克隆抗體。本專利技術提供一種能產生高滴度 抗體的免疫方案。 為了檢測特異性抗體，建立直接競爭酶聯免疫測定，必須合成甲羥孕酮與一種酶 交聯的抗原_酶交聯物(酶標抗原)，交聯的酶包括辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，P _半 乳糖苷酶等。本專利技術公開一種合成甲羥孕酮與酶交聯的方法，以制備酶標抗原。 在以上基礎上，組裝檢測試劑盒。用聚苯乙烯96孔或48孔酶標板，包被二抗。(選 用羊抗兔抗體，有商品供給。 一般選用效價高，效價在l : 1000 2000以上、穩定性好的 二抗。)。 優化包被濃度，抗體濃度，酶標抗原濃度，使之達到檢測要求。 本專利技術提供組成試劑盒相關試劑的配制及組裝流程 (1)用選購的二抗包被酶標板。(2)孵育后洗滌去未吸附上的多余二抗。(3)用 另一種蛋白封閉板上未吸附二抗的多余位點，以減少測定時的非特異性吸附。(4)提供甲 羥孕酮抗體和甲羥孕酮-酶交聯物(酶標抗原)濃縮液。(5)提供抗體和酶標抗原應用稀 釋液。(6)提供濃縮洗滌液(7)提供甲羥孕酮的標準液，用樣品制備液配制7個標準0ng/ ml ， 0. lng/ml ， 0. 5ng/ml ， 1. Ong/ml ， 5. Ong/ml ， 10. Ong/ml ， 20. Ong/ml (8)提供酶顯色緩沖溶 液和酶底物液，本試劑盒所用的酶底物為H202和四甲基聯苯胺(TMP) ， H202配于顯色緩沖溶 液中，四甲基聯苯胺(TMP)單獨配制。(8)提供酶反應終止液，終止液為2M硫酸。(9)提供 樣品制備液。為配制甲羥孕酮標準和測定時樣品的制備。 以上試劑均放4 °C冰箱保存。 應用本試劑盒檢測甲羥孕酮的檢測步驟 (1)按照測定樣品數和制作標準曲線所需孔數(每樣品和標準均作二個孔)，從冰 箱取出所需用的孔條，放置使溫度平衡至室溫(25°C )。 (2)將甲羥孕酮抗體濃縮液用抗體稀釋液按1 : IOO稀釋后，每孔加lOOiU，加 蓋，室溫放置30分鐘。 (3)將濃縮洗滌液用雙蒸餾水按1 : 9稀釋后，作為洗滌液，倒去孔中抗體液，用洗 滌液洗滌3次，每孔，每次250iU，每次加洗滌液后，靜置3分鐘，倒掉，甩干，再進行下一次 洗滌。最后一次洗滌，盡量將液體甩掉。 (4)各孔加入標準或樣品，各標準和樣品各加2孔，每孔加50 iU。將酶標抗原濃 縮液，用抗體稀釋液按l : 100稀釋后，每孔加50iU。另取2孔，加0標準50iU和抗體稀 釋液50 iU作為空白孔，稍平行振蕩酶標板，混勻各孔中液體。加蓋，室溫放置30分鐘。 (5)同(3)洗滌各孔，最后甩干。 (6)各孔加顯色液lOOiU，顯色液由顯色緩沖液與TMB液組成，臨用時以10 : 1 配制(即1000 ii 1顯色緩沖液加100 ill TMB液)。加入后，加蓋，室溫暗處避光放置15分 鐘。 (7)每孔加終止液50 ii 1，混勻，于30分鐘內，用酶標儀，在波長450nm下，測定其光密度。 用各孔的0D45。減去空白孔的0D45。，得各孔的實際測定值。求出二平行孔的平均值， 得各標準或樣品的測定值。按照下式求出各標準和樣品的抑制率 各標準或樣品的抑制率％ =(各標準或樣品的測定值/0標準的測定值)X 100% 用各標準濃度的對數值為X，其相應的抑制率為Y，在坐標軸上作圖，得甲羥孕酮4濃度的半對數坐標標準曲線，在標準曲線上，找出樣品抑制率相對應的X軸上的點，就可計 算出樣品中甲羥孕酮的濃度。現已有ELISA計算的相關軟件，利用這些軟件，只要輸入測定 值，立即就可得出結果。 本試劑盒所用的檢測方法，屬直接競爭酶聯免疫測定方法。96孔酶標板已預先包 被了二抗，加入甲羥孕酮的特異性抗體，此抗體與二抗結合后，固定在酶標板上。然后，加入 標準抗原或含有甲羥孕酮的樣品，和酶標_甲羥孕酮，標準或樣品中甲羥孕酮與酶標_甲羥 孕酮，共同競爭與甲羥孕酮抗體結合，經孵育后，洗滌去未結合的酶標_甲羥孕酮，顯色測 定。測定值與標準或樣本文檔來自技高網...
【技術保護點】
本專利技術公開一種測定甲羥孕酮的直接競爭酶聯免疫試劑盒。其特征包括：免疫原的制備，酶標抗原的制備，抗體制備和試劑盒各組份的配制及酶標板的包被。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王武康，徐基芳，王文卓，
申請(專利權)人：王武康，
類型：發明
國別省市：31[中國|上海]
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