一種肝細胞肝癌術后復發預測基因芯片制造技術

本發明專利技術提供了一種肝細胞肝癌術后復發預測基因芯片，其特征在于，所述芯片以ＥＰＡＳ１、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＮＥＤＤ９、ＥＰＣ２和ＵＳＰ３６基因為檢測位點，以β－肌動蛋白為內參，以ＥＰＡＳ１、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＮＥＤＤ９、ＥＰＣ２和ＵＳＰ３６基因的上游引物和下游引物作為檢測探針。本發明專利技術具有診斷預測準確、快速，方法簡單、易于推廣應用等特點。可用于臨床指導肝癌術后的輔助治療，降低高危肝癌患者術后復發率，從而改善肝癌患者的預后。這組基因標簽對于甲胎蛋白陰性及早期肝癌病人預后的判斷具有重要的臨床意義。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種肝細胞肝癌術后復發預測基因芯片，屬于基因

技術介紹
我國是全球肝癌高發區，每年約20萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡人數的一半左右。 現代醫學對肝癌進行科學研究一百多年，雖然取得了不少成績，但肝癌人群的總體5年生 存率至今仍只有3%左右，而提高肝癌預后的最大障礙是其極高的復發率，即使是根治性手 術切除，仍有50%的病人會在5年內出現轉移或復發。因此，預測肝癌病人術后復發以便 早期進行必要的干預是進一步改善肝癌預后的關鍵。目前臨床上雖然有一些預測肝癌預后 的標志物，但對于早期肝癌(TNM分期I期)及甲胎蛋白(AFP)陰性肝癌病人仍缺乏有效 的預測手段。我們前期研究表明，利用基因芯片技術篩選癌中的差異表達基因可以來預測肝癌術后 復發。大量研究表明腫瘤干細胞是腫瘤轉移和復發的根本來源。我們前期研究表明肝癌中 側群細胞具有腫瘤干細胞樣細胞的特性，并且發現側群細胞和主群細胞之間基因差異表達 譜和肝癌的轉移復發關系密切。但是，由于芯片技術操作過于繁復，技術要求高，費用昂 貴，涉及基因數目龐大從而限制其在臨床上的應用，而利用定量聚合酶鏈式反應(PCR) 技術來聯合檢測數個關鍵基因，為肝癌的分子分型提供了一種在臨床上易于實施的方案。 因此，我們從肝癌干細胞樣細胞的差異基因表達譜中進一步篩選，從中挑選出5個關鍵基 因能夠較好的預測肝癌病人轉移和復發。到目前為止，從肝癌腫瘤干細胞樣細胞的差異基 因表達譜中篩選預后相關基因的類似研究在國內外未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的一種能夠方便運用于臨床、能夠預測肝細胞肝癌術后復發的基因芯片。 為了達到上述目的，本專利技術的技術方案是提供一種肝細胞肝癌術后復發預測基因芯片，其 特征在于，所述芯片以EPAS1、 JMJD1C、 NEDD9、 EPC2和USP36基因為檢測位點，以e_ 肌動蛋白為內參，以EPAS1基因上游引物5' TGCTACGCCACCCAGTACCA3'和下游引物 5' CAGTTCGGGCAGCAGGTAGG3 ， 、 JMJD1C基因上游引物5' CAGCGGGAGCACTTCATCAG3 ，和下 游引物 5， TTCCTTCAAAAGTCTCAGTTCCTGTG3' 、 NEDD9 基因上游引物 5， CCCAAACCGAAGTCATAGCC3，和下游引物5， CAGGAACAGCCACCAATAAGC3， 、 EPC2基因上游引物5， CATTTGGGAGACTATGGTGGT3，和下游引物CTCTGCTTTAGGCTTCTTTGG3， 、 USP36基因 上游引物5， CGAAGAGTTTGACCGAGGGAAG3'和下游引物5' GCAGCCTTTGCTGGGTGAGT3，、以 及 e-肌動蛋白上游引物 5'AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC 3'和下游引物 5' TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3'作為檢測探針。本專利技術的原理如下本專利技術采用流式細胞分選技術篩選肝細胞肝癌細胞株中側群細 胞，利用基因芯片技術篩選出側群細胞和主群細胞之間的差異基因表達譜，而后在臨床病 人組織標本基因表達譜中篩選出一組能夠較好地預測肝細胞肝癌術后復發的5個基因。這 五個基因是EPAS1， JMJD1C， NEDD9， USP36和EPC2。如圖1所示，為獲得5個基因標簽 的分析流程圖，利用基因芯片技術篩選出側群細胞和主群細胞之間的差異基因表達譜。我 們發現在268例臨床病人中，基因表達和差異基因表達譜相似的病人預后較差。為了便于 臨床應用，對于差異基因表達譜進行進一步篩選，從中挑選出一組能夠預測病人預后的基 因組合。將268例臨床病人組織標本隨機分成訓練集和測試集，從訓練集中篩選能夠預測 病人術后復發的基因組合，并且在測試集中進行驗證。我們從中挑選出一組能夠較好地預 測肝細胞肝癌術后復發的含有5個基因的預測模型，并且最終采用實時熒光定量PCR在另 一組100例臨床病人中進行驗證。圖2為五個基因標簽在訓練集中對肝癌病人術后總體生 存的生存曲線，如圖2所示含有5個基因的預測模型能夠預測訓練集肝癌病人術后總體生 存，模型預測為高風險組的生存時間明顯縮短(p=0.014)。圖3為五個基因標簽在訓練集 中對肝癌病人術后復發的生存曲線；如圖3所示含有5個基因的預測模型能夠預測訓練集 肝癌病人術后復發，模型預測為高風險組的復發時間明顯提前(p=0.002)。圖4為五個基 因標簽在測試集中對肝癌病人術后總體生存的生存曲線；如圖4所示含有5個基因的預測 模型能夠預測測試集中肝癌病人術后總體生存，模型預測為高風險組的生存時間明顯縮短 (pO.OOOl)。圖5為五個基因標簽在測試集中對肝癌病人術后復發的生存曲線；如圖5 所示含有5個基因的預測模型能夠預測測試集中肝癌病人術后復發，模型預測為高風險組 的復發時間明顯提前(p<0.0001)。圖6為五個基因標簽在驗證集中對肝癌病人術后總體 生存的生存曲線；如圖6所示含有5個基因的預測模型能夠預測驗證集中肝癌病人術后總 體生存，模型預測為高風險組的生存時間明顯縮短(p=0.009)。圖7為五個基因標簽在驗 證集中對肝癌病人術后復發的生存曲線。如圖7所示含有5個基因的預測模型能夠預測驗 證集中肝癌病人術后復發，模型預測為高風險組的復發時間明顯提前(p=0.003)。本專利技術可通過利用定量PCR的方法來檢測這5個基因在肝癌組織標本中的表達情況， 篩選出高復發風險的肝癌病人。本專利技術具有診斷預測準確、快速，方法簡單、易于推廣應用等特點。可用于臨床指導肝癌術后的輔助治療，降低高危肝癌患者術后復發率，從而改 善肝癌患者的預后。這組基因標簽對于甲胎蛋白陰性及早期肝癌病人預后的判斷具有重要 的臨床意義。 附圖說明圖1為獲得5個基因標簽的分析流程圖2為五個基因標簽在訓練集中對肝癌病人術后總體生存的生存曲線；圖3為五個基因標簽在訓練集中對肝癌病人術后復發的生存曲線；圖4為五個基因標簽在測試集中對肝癌病人術后總體生存的生存曲線；圖5為五個基因標簽在測試集中對肝癌病人術后復發的生存曲線；圖6為五個基因標簽在驗證集中對肝癌病人術后總體生存的生存曲線；圖7為五個基因標簽在驗證集中對肝癌病人術后復發的生存曲線。具體實施例方式以下結合附圖和實施例對本專利技術作進一步說明。實施例一種肝細胞肝癌術后復發預測基因芯片，以EPAS1、 JMJD1C、 NEDD9、 EPC2和USP36 基因為檢測位點，以e-肌動蛋白為內參，以下表所示引物為檢測探針，其計算機可讀形 式副本見附件<table>table see original document page 6</column></row><table>上述PCR芯片的制備方法如下采用預制PCR芯片的形式，將RT2 SY服Green/R0X qPCR master mix (SABiosciences， catalog number:PA-122) ，預點于96孔實時定量PCR板(ABI 公司生產)，于-2(TC保存。96孔實時定量PCR板，每排12 L，每個基因設復孔，共12孔， 每排檢測一個病人，可以同時檢測8個病人。上述基因芯片的使用方法如下本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種肝細胞肝癌術后復發預測基因芯片，其特征在于，所述芯片以ＥＰＡＳ１、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＮＥＤＤ９、ＵＳＰ３６、和ＵＳＰ３６基因為檢測位點，以β－肌動蛋白為內參，以ＥＰＡＳ１基因上游引物５’ＴＧＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＣＡＧＴＡＣＣＡ３’和下游引物５’ＣＡＧＴＴＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＧＧ３’、ＪＭＪＤ１Ｃ基因上游引物５’ＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＡＣＴＴＣＡＴＣＡＧ３’和下游引物５’ＴＴＣＣＴＴＣＡＡＡＡＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧ３’、ＮＥＤＤ９基因上游引物５’ＣＣＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣ３’和下游引物５’ＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣ３’、ＥＰＣ２基因上游引物５’ＣＡＴＴＴＧＧＧＡＧＡＣＴＡＴＧＧＴＧＧＴ３’和下游引物ＣＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧ３’、ＵＳＰ３６基因上游引物５’ＣＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＣＣＧＡＧＧＧＡＡＧ３’和下游引物５’ＧＣＡＧＣＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＴＧＡＧＴ３’、以及β－肌動蛋白上游引物５’ＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣ　３’和下游引物５’ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ　３’作為檢測探針。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：樊嘉，徐泱，楊欣榮，周儉，邱雙健，
申請(專利權)人：復旦大學附屬中山醫院，
類型：發明
國別省市：31[中國|上海]