多肽原料藥比伐盧定的制備及純化方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種多肽原料藥比伐盧定的制備純化方法，包括以下步驟：樹脂的溶脹以及脫保護(hù)：稱取所需的樹脂投入固相多肽反應(yīng)釜中，用二氯甲烷進(jìn)行溶脹，用六氫吡啶/DMF去保護(hù)，使樹脂的氨基裸露，呈陽性；偶聯(lián)：向固相多肽反應(yīng)釜中加入偶聯(lián)液，與上述已脫保護(hù)完全且洗滌至中性的樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，然后依次偶聯(lián)序列氨基酸，獲得肽樹脂；脫保護(hù)及收料；裂解及洗滌干燥，得比伐盧定粗肽；然后進(jìn)行粗品比伐盧定肽的純化，獲得高純度的多肽原料藥比伐盧定。本發(fā)明專利技術(shù)簡化了比伐盧定的制備工藝，能降低生產(chǎn)成本，提高制備效率，本發(fā)明專利技術(shù)的制備純化方法，能快速純化比伐盧定，得到純度99.5%以上，單雜小于0.1%的比伐盧定純品，能大大提高比伐盧定的純化效率。盧定的純化效率。盧定的純化效率。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
多肽原料藥比伐盧定的制備及純化方法


[0001]本專利技術(shù)涉及多肽原料藥比伐盧定的制備方法，具體涉及一種純度為99.5％以上的比伐盧定的制備純化方法。

技術(shù)介紹

[0002]比伐盧定是一種人工合成的抗凝血藥物，是水蛭素的20肽類似物。現(xiàn)有技術(shù)中，比伐盧定的制備方法通常通過固相多肽合成法制備比伐盧定肽樹脂，然后比伐盧定肽樹脂裂解得比伐盧定粗品，再進(jìn)行比伐盧定粗品純化得到純品的比伐盧定。公開號為CN107344967A的專利，公開了一種比伐盧定的制備及純化方法，并具體公開了制備及純化步驟如下：以2
?
Cl
?
Resin為載體，通過固相合成方法，以Fmoc和/或Boc保護(hù)氨基酸為原料，氨基酸投料量與樹脂載樣量按一定摩爾比，縮合、脫保護(hù)依次得到保護(hù)的[1
?
10]肽樹脂，從樹脂上裂解下來后進(jìn)行純化，得到白色固體片段1，片段1的結(jié)構(gòu)如下：Boc
?
D
?
PHe
?
Pro
?
Arg(Pbf)
?
Pro
?
Gly
?
Gly
?
Gly
?
Gly
?
Asn(Trt)
?
Gly
?
OH；以2
?
Cl
?
Resin為載體，通過固相合成方法，以Fmoc保護(hù)氨基酸為原料，氨基酸投料量與樹脂載樣量按一定摩爾比，縮合、脫保護(hù)依次得到保護(hù)的[11<br/>?
20]肽樹脂，記為片段2，結(jié)構(gòu)如下：Fmoc
?
Asp(OtBu)
?
PHe
?
Glu(OtBu)
?
Glu(OtB u)
?
Ile
?
Pro
?
Glu(OtBu)
?
Glu(OtBu)
?
Tyr(tBu)
?
Leu
?
樹脂；片段1與片段2按一定摩爾比固相接入片段2樹脂，使用裂解劑脫掉保護(hù)基及樹脂，并經(jīng)高效液相制備純化、冷凍干燥，即得比伐盧定純品。這種方法采用了片段1樹脂和片段2樹脂分別制備，再將片段1按比例接入片段2的方法來制備肽樹脂，這種方法的缺點(diǎn)在于工藝過程復(fù)雜，需要先制備兩個(gè)片段，得到片段1樹脂和片段2樹脂后還要分別進(jìn)行純化處理，然后再將片段1樹脂和片段2樹脂連接起來，再通過裂解劑去除樹脂，整個(gè)工藝過程步驟繁多，且反應(yīng)過程需要大量的反應(yīng)試劑，導(dǎo)致產(chǎn)品的制備成本較高。其次，該方案中不僅要對片段1和片段2分別進(jìn)行純化，而且對于得到的比伐盧定粗品還要進(jìn)行純化，純化采用了高效液相色譜法，純化條件：以十八烷基鍵合硅膠為固定相(YMC公司的Triart Prep C18
?
S)，色譜柱規(guī)格為250
×
30mm，粒徑10μm，粒空隙12nm，流動(dòng)相A：0.1％三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，檢測波長210nm，設(shè)置洗脫梯度。這種純化方法的缺點(diǎn)為，純化效率低，無法一次純化得到高純度的比伐盧定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0003]本專利技術(shù)的專利技術(shù)目的是針對
技術(shù)介紹
中所述的現(xiàn)有技術(shù)中比伐盧定的制備純化方法存在的制備工藝復(fù)雜，純化效率低等問題，提供一種能夠解決這些問題的多肽原料藥比伐盧定的制備方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)以上目的，本專利技術(shù)通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：一種多肽原料藥比伐盧定的制備純化方法，包括以下步驟：
[0005]S1、樹脂的溶脹以及脫保護(hù)：稱取所需的樹脂投入固相多肽反應(yīng)釜中，用二氯甲烷進(jìn)行溶脹，用六氫吡啶/DMF去保護(hù)，使樹脂的氨基裸露，呈陽性；
[0006]S2、偶聯(lián)：向固相多肽反應(yīng)釜中加入偶聯(lián)液，與步驟S1中已脫保護(hù)完全且洗滌至中性的樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，控制反應(yīng)轉(zhuǎn)速為70～110轉(zhuǎn)/分，反應(yīng)溫度在26℃～32℃之間，反應(yīng)時(shí)間控制在1.5～3小時(shí)之間，用不銹鋼取樣器從反應(yīng)瓶中取少量樹脂加入檢測管中做茚三酮檢測，若呈陽性，則需要延長反應(yīng)時(shí)間直至茚三酮檢測陰性，偶聯(lián)劑與樹脂上的氨基偶聯(lián)結(jié)束后，用DMF洗滌若干次，重復(fù)脫保護(hù)，然后依次偶聯(lián)序列氨基酸，獲得肽樹脂；
[0007]S3、脫保護(hù)及收料：用六氫吡啶/DMF對肽樹脂進(jìn)行脫保護(hù)，然后用干燥的DMF洗滌肽樹脂，洗滌至檢測pH值6.4～7.2之間，進(jìn)行茚三酮檢驗(yàn)應(yīng)為陽性，用甲醇洗滌若干次，然后用DCM洗滌若干次，最后再用甲醇洗滌若干次，抽干，晾至恒重；
[0008]S4、裂解及洗滌干燥：將步驟S3處理后的肽樹脂中加入裂解劑，攪拌并控制反應(yīng)溫度不超過30℃，反應(yīng)2.5h
?
3h；反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行減壓抽濾，用少量TFA洗滌樹脂將已預(yù)凍至0℃的沉降液冰乙醚倒入燒杯中，加入抽濾所得裂解液，并緩慢攪拌3
?
10min，然后靜置，待沉降完全，抽去大部分上清液做廢液，離心沉降液得白色沉淀，離心后樣品用冰乙醚攪碎洗滌若干次，離心結(jié)束后，固體樣品通風(fēng)晾干，得比伐盧定粗肽；
[0009]S5、粗品比伐盧定肽的純化，包括以下步驟：
[0010]A1、獲得餾分，條件為：
[0011]色譜柱：50mm I.D.x 250mm；填充物：Daisogel 100
?8?
ODS
?
P；檢測波長：215nm，流速：63ml/min；上樣量：按填料重量計(jì)0.6％；流動(dòng)相A：0.1％的磷酸水溶液，用氨水調(diào)pH至4.0；流動(dòng)相B：乙腈；根據(jù)制備譜圖收集餾分；
[0012]A2、轉(zhuǎn)鹽操作，轉(zhuǎn)鹽條件為：色譜柱：50mm I.D.x 250mm；填充物：Daisogel 100
?8?
ODS
?
P；檢測波長：215nm；流速：63ml/min；上樣量：按填料重量計(jì)0.6％；流動(dòng)相A：0.1％三氟乙酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；等度淋洗轉(zhuǎn)鹽
[0013]A3、獲得比伐盧定產(chǎn)品：用高比例有機(jī)相沖出，在小于35℃水浴條件下減壓濃縮，蒸發(fā)去除大部分乙腈，得到三氟乙酸比伐盧定鹽溶液，冷凍干燥得純度在99.5％以上的比伐盧定產(chǎn)品。
[0014]在上述方案中，步驟S1中，樹脂選用100
?
200目的Wang樹脂，投入固相多肽反應(yīng)釜中；加入二氯甲烷溶脹，抽去反應(yīng)液，然后用DMF溶液洗滌3
?
5次，抽去反應(yīng)液；然后進(jìn)行去保護(hù)操作，具體過程為，將溫度控制在18℃
?
25℃，預(yù)洗后用DMF洗滌3
?
5次，單次清洗5min，抽去洗滌液，加六氫吡啶/DMF去保護(hù)10min，去保護(hù)完成后，用DMF洗滌至pH試紙檢測在7.0
?
7.2之間，取少量樹脂，加入茚三酮溶液進(jìn)行檢驗(yàn)，在120℃
?
150℃加熱3
?
10min，若樹脂顯無色或淡黃色透明，則表明樹脂氨基被保護(hù)，呈陰性，若樹脂顯藍(lán)色或有本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種多肽原料藥比伐盧定的制備純化方法，其特征在于，包括以下步驟：S1、樹脂的溶脹以及脫保護(hù)：稱取所需的樹脂投入固相多肽反應(yīng)釜中，用二氯甲烷進(jìn)行溶脹，用六氫吡啶/DMF去保護(hù)，使樹脂的氨基裸露，呈陽性；S2、偶聯(lián)：向固相多肽反應(yīng)釜中加入偶聯(lián)液，與步驟S1中已脫保護(hù)完全且洗滌至中性的樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，控制反應(yīng)轉(zhuǎn)速為70～110轉(zhuǎn)/分，反應(yīng)溫度在26℃～32℃之間，反應(yīng)時(shí)間控制在1.5～3小時(shí)之間，用不銹鋼取樣器從反應(yīng)瓶中取少量樹脂加入檢測管中做茚三酮檢測，若呈陽性，則需要延長反應(yīng)時(shí)間直至茚三酮檢測陰性，偶聯(lián)劑與樹脂上的氨基偶聯(lián)結(jié)束后，用DMF洗滌若干次，重復(fù)脫保護(hù)，然后依次偶聯(lián)序列氨基酸，獲得肽樹脂；S3、脫保護(hù)及收料：用六氫吡啶/DMF對肽樹脂進(jìn)行脫保護(hù)，然后用干燥的DMF洗滌肽樹脂，洗滌至檢測pH值6.4～7.2之間，進(jìn)行茚三酮檢驗(yàn)應(yīng)為陽性，用甲醇洗滌若干次，然后用DCM洗滌若干次，最后再用甲醇洗滌若干次，抽干，晾至恒重；S4、裂解及洗滌干燥：將步驟S3處理后的肽樹脂中加入裂解劑，攪拌并控制反應(yīng)溫度不超過30℃，反應(yīng)2.5h
?
3h；反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行減壓抽濾，用少量TFA洗滌樹脂將已預(yù)凍至0℃的沉降液冰乙醚倒入燒杯中，加入抽濾所得裂解液，并緩慢攪拌3
?
10min，然后靜置，待沉降完全，抽去大部分上清液做廢液，離心沉降液得白色沉淀，離心后樣品用冰乙醚攪碎洗滌若干次，離心結(jié)束后，固體樣品通風(fēng)晾干，得比伐盧定粗肽；S5、粗品比伐盧定肽的純化，包括以下步驟：A1、獲得餾分，條件為：色譜柱：50mm I.D.x 250mm；填充物：Daisogel 100
?8?
ODS
?
P；檢測波長：215nm，流速：63ml/min；上樣量：按填料重量計(jì)0.6%；流動(dòng)相A：0.1%的磷酸水溶液，用氨水調(diào)pH至4.0；流動(dòng)相B：乙腈；根據(jù)制備譜圖收集餾分；A2、轉(zhuǎn)鹽操作，轉(zhuǎn)鹽條件為：色譜柱：50mm I.D.x 250mm；填充物：Daisogel 100
?8?
ODS
?
P；檢測波長：215nm；流速：63ml/min；上樣量：按填料重量計(jì)0.6%；流動(dòng)相A：0.1%三氟乙酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；等度淋洗轉(zhuǎn)鹽A3、獲得比伐盧定產(chǎn)品：用高比例有機(jī)相沖出，在小于35℃水浴條件下減壓濃縮，蒸發(fā)去除大部分乙腈，得到三氟乙酸比伐盧定鹽溶液，冷凍干燥得純度在99.5%以上的比伐盧定產(chǎn)品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽原料藥比伐盧定的制備純化方法，其特征在于：...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：請求不公布姓名，
申請(專利權(quán))人：蘇州宇莘新材料有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：