具有隱窩-絨毛軸結構的人源腸類器官及其制備方法、應用技術

本申請涉及一種具有隱窩

【技術實現步驟摘要】
具有隱窩
?
絨毛軸結構的人源腸類器官及其制備方法、應用


[0001]本申請涉及細胞培養
，特別是涉及一種具有隱窩
?
絨毛軸結構的人源腸類器官的制備方法。

技術介紹

[0002]腸黏膜上皮是更新最快的組織之一，所有分化類型細胞的持續更迭始于內陷的隱窩基底部干細胞生態位，其異常將迅速引起腸屏障的破壞，導致腸道增生、炎癥和癌癥。腸上皮細胞的分布層次始于內陷的隱窩基部，這是主要的腸干細胞生態位。干細胞分裂形成的子細胞向外分化、成熟形成突出的絨毛，構成特征性的隱窩
?
絨毛軸結構。上皮下主要起源于中胚層的一群異質的間充質細胞，包括上皮下成纖維細胞和肌成纖維細胞等，構成了緊鄰腸道上皮的主要基質細胞群。
[0003]然而，腸上皮隱窩
?
絨毛軸結構中內陷的隱窩基部的干細胞生態位異常是造成許多腸疾病發生的原因。因此，有良好的干細胞生態位結構的腸類器官模型在研究疾病發生機理中至關重要。例如，Notch信號通路參與了癌癥生物學的許多方面，包括血管生成、腫瘤免疫和癌癥干細胞樣細胞的維持。在過去的20年里，已經開發了幾種Notch靶向治療策略，許多藥物已經一些臨床癌癥試驗中進行了評估。然而，這一治療方案帶來一系列副作用，特別是胃腸道系統的劑量限制毒性，導致的腸干細胞生態位的破壞和腸上皮干細胞分化異常，表現為腸粘膜受損和嚴重的分泌型腹瀉，通常是腸上皮分泌型細胞，如潘氏細胞、杯狀細胞和內分泌細胞大量增加導致。
[0004]但是，在目前的人源腸類器官構建方案中，人源腸類器官難以形成形態良好的典型隱窩
?
絨毛軸的干細胞生態位結構。

技術實現思路

[0005]基于此，本申請一方面提供一種能形成具有良好隱窩干細胞生態位結構的人源腸類器官的制備方法，具體方案如下：
[0006]提供人多能干細胞誘導分化形成的腸類器官；
[0007]將所述腸類器官置于氣液相界面進行培養，制備所述具有隱窩
?
絨毛軸結構的人源腸類器官；
[0008]所述氣液相界面中的液相為重組膠原基質，所述重組膠原基質包括細胞培養用膠原和DMEM/F
?
12培養基，且所述細胞培養用膠原與所述DMEM/F
?
12培養基的體積比為(7～8)：(2～3)，所述DMEM/F
?
12培養基中含有0.1μmol/L～1μmol/L的WNT激動劑。
[0009]在其中一些實施例中，所述WNT激動劑包括CHIR99021及WNT3A中的至少一種。
[0010]在其中一些實施例中，所述DMEM/F
?
12培養基還包括1～2
×
B27、1～2
×
N2、80ng/mL～120ng/mL表皮生長因子、0.1mmol/L～5mmol/L L
?
谷氨酰胺、10mmol/L～20mmol/L HEPES緩沖液。
[0011]在其中一些實施例中，將所述腸類器官置于氣液相界面進行培養的步驟，包括如
下步驟：
[0012]在細胞培養小室的內皿中加入400μL～1000μL所述重組膠原基質，凝固后，在外孔中加入所述DMEM/F
?
12培養基使得液面低于所述重組膠原基質包備的細胞培養小室的上表面；
[0013]再將所述腸類器官放置在所述重組膠原基質上進行培養。
[0014]在其中一些實施例中，所述人多能干細胞誘導分化的腸類器官的制備方法包括以下步驟：
[0015]步驟S10：將人多能干細胞誘導分化形成限制性內胚層；
[0016]步驟S20：將所述限制性內胚層誘導分化形成中后腸球；
[0017]步驟S30：將所述中后腸球誘導分化形成腸類器官。
[0018]在其中一些實施例中，所述細胞培養用膠原選自Cellmatrix I
?
A型膠原蛋白。
[0019]在其中一些實施例中，所述人多能干細胞為人胚胎干細胞和/或人誘導多能干細胞。
[0020]本申請另一方面提供一種具有隱窩
?
絨毛軸結構的人源腸類器官，根據上述的制備方法制備得到。
[0021]本申請還提供一種藥物性腸病類器官模型的制備方法，包括以下步驟：
[0022]提供上述的具有隱窩
?
絨毛軸結構的人源腸類器官；
[0023]將所述具有隱窩
?
絨毛軸結構的人源腸類器官在含有γ
?
分泌酶抑制劑的培養基中進行培養。
[0024]本申請還提供一種藥物性腸病類器官模型，根據上述的制備方法制備得到。
[0025]通過調控特定細胞培養用膠原和DMEM/F
?
12培養基的特定配比，將多能干細胞誘導分化的腸類器官置于氣液相界面進行培養，從而獲得具有良好隱窩干細胞生態位結構的人源腸類器官，在此基礎上，可用于形成模擬Notch靶向治療導致的藥物性腸病模型，篩選或鑒定用于治療藥物性腸病的藥物。
附圖說明
[0026]圖1為實施例1中hESCs向具有絨毛
?
隱窩軸結構的腸類器官分化的階段示意圖；
[0027]圖2為實施例1中WNT激動劑對類器官隱窩
?
絨毛軸結構的生長影響，黑框內顯示類隱窩
?
絨毛軸結構，黑色剪頭顯示上皮分化異常；
[0028]圖3為實施例1中氣液相交界培養條件下人源類器官顯微觀察圖；
[0029]圖4為實施例1中氣液相培養條件下激光共聚焦顯微圖；
[0030]圖5為實施例1中DAPT導致的藥物性腸病類器官激光共聚焦顯微圖；
[0031]圖6為對比例1中成體腸干細胞來源的腸類器官。
具體實施方式
[0032]為了便于理解本申請，下面將對本申請進行更全面的描述，本申請可以以許多不同的形式來實現，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使本申請公開內容更加透徹全面。
[0033]除非另有定義，本文所使用的所有的技術和科學術語與屬于本申請的
的
技術人員通常理解的含義相同。本文中在本申請的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本申請。在本文中“可選地”表示舉例。
[0034]術語
[0035]WNT激動劑，被定義為激活細胞中TCF/LEF介導的轉錄的試劑。
[0036]表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)是最早發現的生長因子，對調節細胞生長、增殖和分化起著重要作用。
[0037]成纖維細胞生長因子FGF(Fibroblast Growth Factors，FGFs)是由約150
?
200氨基酸組成的多肽，作為細胞間信號分子在胚胎發生和分化過程中起重要作用。
[0038]類器官是指原代組織提取出來的成體本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種具有隱窩
?
絨毛軸結構的人源腸類器官的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：提供人多能干細胞誘導分化形成的腸類器官；將所述腸類器官置于氣液相界面進行培養，制備所述具有隱窩
?
絨毛軸結構的人源腸類器官；所述氣液相界面中的液相為重組膠原基質，所述重組膠原基質包括細胞培養用膠原和DMEM/F
?
12培養基，且所述細胞培養用膠原與所述DMEM/F
?
12培養基的體積比為(7～8)：(2～3)，所述DMEM/F
?
12培養基中含有0.1μmol/L～1μmol/L的WNT激動劑。2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述WNT激動劑包括CHIR99021及WNT3A中的至少一種。3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述DMEM/F
?
12培養基還包括1～2
×
B27、1～2
×
N2、80ng/mL～120ng/mL表皮生長因子、0.1mmol/L～5mmol/L L
?
谷氨酰胺、10mmol/L～20mmol/L HEPES緩沖液。4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，將所述腸類器官置于氣液相界面進行培養的步驟，包括如下步驟：在細胞培養小室的內皿中加入4...

【專利技術屬性】
技術研發人員：曾思聰，李進，戴聰伶，何彩霞，
申請(專利權)人：中信湘雅生殖與遺傳?？漆t院有限公司，
類型：發明
國別省市：