培養鼻黏膜基底層上皮干細胞的方法技術

本發明專利技術公開了一種培養鼻黏膜基底層上皮干細胞的方法：采用鼻刷刮取的方式，從鼻腔黏膜深處獲取細胞，進行傳代培養及干性驗證；在鼻腔黏膜基底層上皮干細胞的融合度達到80％～90％時，對鼻腔黏膜基底層上皮干細胞進行傳代或凍存。利用本發明專利技術的培養方法，能夠通過相對簡單且方便的方法培養鼻腔黏膜基底層上皮干細胞，便于熟練掌握細胞培養的整體流程、復蘇、換液、傳代及凍存操作，具有培養成本低，培養操作流程簡單可靠等優點。養操作流程簡單可靠等優點。養操作流程簡單可靠等優點。

【技術實現步驟摘要】
培養鼻黏膜基底層上皮干細胞的方法


[0001]本專利技術涉及一種培養鼻黏膜基底層上皮干細胞的方法，屬于干細胞培養


技術介紹

[0002]呼吸道(respiratorytract)是人體直接對外界開放的器官之一，鼻腔氣道上皮細胞作為呼吸道的門戶是人體一道重要的生理防御屏障，在抵御病原微生物入侵及清除有毒物質等方面起著重要的作用。氣道和呼吸肺泡源自原始內胚層的不同原基(buds)，即氣管原基和肺原基，兩個原基中含有不同的干細胞，分別稱為近端(proximal)和遠端(distal)干細胞。近端干細胞即是氣道基底干細胞(Basal stem cells)，遠端干細胞包括細支氣管基底干細胞(Basal stem cells)、呼吸性細支氣管與肺泡導管連接處(BADJ)的干細胞(bronchioalveolar stem cells，BASCs)以及肺泡Ⅱ型細胞。目前研究的共識是，沿著氣道至肺分布著不同干細胞，他們具有區域性(region specific)，例如近端的氣道干細胞不能分化成遠端肺部的細胞，反之亦然，遠端的干細胞也不能分化為氣道細胞。
[0003]現有研究表明，上呼吸道鼻腔黏膜基底層上皮干細胞和下呼吸道支氣管基底層干細胞所形成的克隆不但形態相同，而且基因表達譜有99.0％的重疊。這些研究包括從動物模型到臨床研究，已經證明從下呼吸道氣管基底層來源的上皮干細胞(p63和Krt5陽性)可以參與肺損傷后的修復及再生。例如：2015年哈佛大學Frank McKeon教授課題組證實H1N1流感病毒感染所致小鼠肺損傷動物模型中，氣管基底層上皮干細胞應激快速擴增，遷移致肺損傷部位并分化成肺泡細胞；2018年同濟大學左為教授團隊開展了人自體支氣管基底層干細胞移植治療支氣管擴張的臨床研究中，兩例病人的數據表明移植后3至6個月，干細胞形成了新的肺泡和支氣管結構，進而替代并修復了損傷的肺組織。因此，分離自鼻黏膜組織的鼻黏膜基底層上皮干細胞(HNEpCs)有著良好的應用前景。然而，目前并未有較好的培養鼻黏膜基底層上皮干細胞的方法。

技術實現思路

[0004]針對上述現有技術，本專利技術提供了一種培養鼻黏膜基底層上皮干細胞的方法，采用鼻刷刮取的方式獲取，方便快捷，培養成本低，且培養所得干細胞的純度較高。
[0005]本專利技術是通過以下技術方案實現的：
[0006]一種培養鼻黏膜基底層上皮干細胞的方法，采用鼻刷刮取的方式，從鼻腔黏膜深處獲取細胞，進行傳代培養及干性驗證；在鼻腔黏膜基底層上皮干細胞的融合度達到80％～90％時，對鼻腔黏膜基底層上皮干細胞進行傳代或凍存。
[0007]進一步地，從鼻腔黏膜深處獲取細胞，進行傳代培養的具體操作為：
[0008](1)刷取鼻腔黏膜基底層上皮干細胞之前，用100μl的LN 521(濃度5μg/ml)鋪24孔板；
[0009](2)用生理鹽水清洗鼻子3次；
[0010](3)鼻拭子伸入鼻甲區，旋轉、前后刷取鼻腔黏膜基底層上皮干細胞；
[0011](4)折斷鼻拭子放入裝有3mL的IMDM(不含FBS，含2.5
×
Amphotericin B，Pen/Strep和慶大霉素20μg/ml)培養基的15mL離心管中；
[0012](5)渦旋劇烈搖晃30次；
[0013](6)用鑷子取出拭子在管壁擠出多余液體，棄鼻拭子，1000rpm離心5min；
[0014](7)棄上清，用0.5ml的TrypLE
TM
Select酶消化2min，0.5ml的IMDM培養基(含10％FBS)終止，槍上下吹打10次，收集濾液；
[0015](8)用DPBS(含2.5
×
Amphotericin B,Pen/Strep和慶大霉素20μg/ml)洗1次，1000rpm離心5min，棄上清；
[0016](9)將樣本種到提前用LN 521鋪板的孔板中，用PneumaCult
TM
?
Ex Plus Medium培養基(含2.5
×
Amphotericin B，Pen/Strep和慶大霉素20μg/ml)；
[0017](10)放入37℃培養箱中培養。
[0018]進一步地，進行干性驗證的具體操作為：
[0019](1)細胞培養：使用PneumaCultTM
?
Ex Plus Medium培養基培養細胞，每兩天換一次液，傳代擴增培養，傳至P2代時將細胞種于CELL SLIP中，細胞貼壁后進行細胞免疫熒光實驗；
[0020](2)從培養箱中拿出細胞，用PBS洗3次，每次5min；
[0021](3)使用5ml 4％多聚甲醛固定15min；
[0022](4)棄去4％多聚甲醛，加5ml 0.5％Triton X
?
100，通透15min；
[0023](5)棄去0.5％Triton X
?
100，加5ml 5％山羊血清封閉液，封閉30min；
[0024](6)棄去封閉液，滴加一抗，保濕盒中4℃過夜孵育；
[0025]所述一抗，包括SOX2抗體和SOX9抗體；
[0026]SOX2抗體，反應種屬：Mouse，Rat，Human，宿主：Rabbit，使用濃度1:1000；
[0027]SOX9抗體，反應種屬：Mouse，Rat，Human，宿主：Rabbit，使用濃度1:240；
[0028](7)吸棄一抗，DPBS洗3次，每次5min；
[0029](8)滴加二抗，避光，37℃，孵育1h；
[0030]所述二抗，包括Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594；
[0031]Alexa Fluor 488，反應種屬：Mouse，宿主：Goat，使用濃度1:500；
[0032]Alexa Fluor 594，反應種屬：Rabbit，宿主Goat，使用濃度1:500；
[0033](9)棄去二抗，DPBS洗3次，每次5min；
[0034](10)滴加抗淬滅封片劑并用蓋玻片封片；
[0035](11)熒光顯微鏡下觀察并拍照。
[0036]進一步地，進行傳代的具體操作為：
[0037](1)采用紫外光對生物安全柜提前照射30min，并將PneumaCult
TM
?
Ex Plus Medium培養基，DPBS和TrypLE
TM
Select酶，提前從4℃冰箱拿出恢復至室溫；
[0038](2)吸出T 75培養瓶中的培養基，使用4ml的DPBS將其清洗兩次；
[0039](3)吸出DPBS，并向培養瓶中加入3ml的TrypLE
TM
Select酶；
[0040](4)旋緊培養瓶的瓶蓋，搖晃培養瓶，并用掌心拍打瓶身，待TrypLE
TM...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種培養鼻黏膜基底層上皮干細胞的方法，其特征在于：采用鼻刷刮取的方式，從鼻腔黏膜深處獲取細胞，進行傳代培養及干性驗證；在鼻腔黏膜基底層上皮干細胞的融合度達到80％～90％時，對鼻腔黏膜基底層上皮干細胞進行傳代或凍存。2.根據權利要求1所述的培養鼻黏膜基底層上皮干細胞的方法，其特征在于：從鼻腔黏膜深處獲取細胞，進行傳代培養的具體操作為：(1)刷取鼻腔黏膜基底層上皮干細胞之前，用100μl的LN 521(濃度5μg/ml)鋪24孔板；(2)用生理鹽水清洗鼻子3次；(3)鼻拭子伸入鼻甲區，旋轉、前后刷取鼻腔黏膜基底層上皮干細胞；(4)折斷鼻拭子放入裝有3mL的IMDM(不含FBS，含2.5
×
Amphotericin B，Pen/Strep和慶大霉素20μg/ml)培養基的15mL離心管中；(5)渦旋劇烈搖晃30次；(6)用鑷子取出拭子在管壁擠出多余液體，棄鼻拭子，1000rpm離心5min；(7)棄上清，用0.5ml的TrypLE
TM
Select酶消化2min，0.5ml的IMDM培養基(含10％FBS)終止，槍上下吹打10次，收集濾液；(8)用DPBS(含2.5
×
Amphotericin B,Pen/Strep和慶大霉素20μg/ml)洗1次，1000rpm離心5min，棄上清；(9)將樣本種到提前用LN 521鋪板的孔板中，用PneumaCult
TM
?
Ex Plus Medium培養基(含2.5
×
Amphotericin B，Pen/Strep和慶大霉素20μg/ml)；(10)放入37℃培養箱中培養。3.根據權利要求1所述的培養鼻黏膜基底層上皮干細胞的方法，其特征在于，進行干性驗證的具體操作為：(1)細胞培養：使用PneumaCultTM
?
Ex Plus Medium培養基培養細胞，每兩天換一次液，傳代擴增培養，傳至P2代時將細胞種于CELL SLIP中，細胞貼壁后進行細胞免疫熒光實驗；(2)從培養箱中拿出細胞，用PBS洗3次，每次5min；(3)使用5ml 4％多聚甲醛固定15min；(4)棄去4％多聚甲醛，加5ml 0.5％Triton X
?
100，通透15min；(5)棄去0.5％Triton X
?
100，加5ml 5％山羊血清封閉液，封閉30min；(6)棄去封閉液，滴加一抗，保濕盒中4℃過夜孵育；所述一抗，包括SOX2抗體和SOX9抗體；SOX2抗體，反應種屬：Mouse，Rat，Human，宿主：Rabbit，使用濃度1:1000；SOX9抗體，反應種屬：Mouse，Rat，Human，宿主：Rabbit，使用濃度1:240；(7)吸棄一抗，DPBS洗3次，每次5min；(8)滴加二抗，避光，37℃，孵育1h；所述二抗，包括Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594；Alexa Fluor 488，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李瓊瓊，潘格，崔玉芹，溫泉，張文華，張智慧，
申請(專利權)人：銀豐生物工程集團有限公司，
類型：發明
國別省市：