一種流感病毒疫苗及其應用制造技術

本發明專利技術涉及醫藥領域，具體公開一種流感病毒疫苗融合蛋白，其由流感HA抗原基因編碼的HA抗原片段與M2胞外區片段（M2e；Membrane Protein (M2) Extracellular Region (M2e)串聯后與人免疫球蛋白基因編碼的Fc片段串聯而成的融合蛋白。本發明專利技術的融合蛋白相比單獨HA抗原、單獨的M2胞外區片段抗原具有更高的抗原性，且其中Fc片段能提升蛋白純化效率，和延長抗原體內半衰期。因此，本發明專利技術提供的流感疫苗具有較大優勢，應用價值較大。應用價值較大。

【技術實現步驟摘要】
一種流感病毒疫苗及其應用


[0001]本專利技術涉及醫藥領域，具體涉及流感病毒疫苗及其應用。

技術介紹

[0002]流行性感冒,簡稱流感,是流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，呈季節性流行，通常每年秋天進入流行季。冬春季達到流行高峰。
[0003]流感病毒屬于正黏病毒科，是一種單股、負鏈RNA基因組病毒，根據病毒核蛋白和基質蛋白的不同，分甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)四種類型,根據其包膜中血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)不同，又可分為不同的亞型(H亞型和N亞型)。甲型病毒經常發生抗原變異，傳染性大，傳播迅速，是引起季節性或者大流行流感的主要病毒。目前感染人的主要是甲型(又稱A型)中的H1N1、H3N2亞型及乙型(又稱B型)中的Victoria和Yamagata系。流感病毒變異的頻率快，每年都會有新的流行毒株發生，其變異主要通過兩種方式進行：抗原漂移和抗原轉變。抗原漂移是由少量的點突變所導致的微小的變化，在甲型和乙型流感中都會發生,它可以使病毒避開免疫系統的識別，造成感染過的人再次發生感染、造成流感反復暴發。抗原轉變是由不同HA抗原的基因重配所引起可以使病毒產生新的亞型，而且可以跨越物種直接感染人類，比如禽流感，主要發生在甲型流感中。
[0004]流感病毒囊膜表面有三種蛋白：HA(血凝素蛋白)、NA(唾液酸苷酶)和M2(通道蛋白)。HA是含量最多的流感表面囊膜蛋白，是病毒黏附受體細胞的主要成分，也是誘導中和抗體產生的主要抗原。目前發現的HA亞型共18種，每個亞種含許多不同毒株，保持HA與近期流行毒株相似是疫苗產生高效中和抗體的基礎。因此，近些年來，世衛組織每年預測、公布和發放主要流行毒株，供給各國疾控部門，方便疫苗生產企業應用。M2是流感病毒囊膜表面除HA和NA外的第三種蛋白，分子量小，每個M2蛋白的膜外區僅23個氨基酸，其選擇壓力小，可變范圍小，變異程度較低。在2019年以來NCBI收錄的所有M2蛋白中，按胞外區序列區分一共僅有10多種，與HA的數千種相比，具有很高的保守性，且實驗證明此段序列具有體液免疫和細胞免疫活性，是開發具有廣泛預防效果的通用疫苗的抗原選擇之一。
[0005]流感病毒主要通過飛沫傳播,口腔、鼻腔、眼睛等黏膜直接或間接接觸被病毒污染物品也可以感染。人群對流感病毒普遍易感，流感病毒直接侵襲人體的呼吸系統，可引起病毒性肺炎、繼發細菌性肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、休克、彌漫性血管內凝血等多種威脅生命的嚴重并發癥。重癥流感主要發生在老年人、年幼兒童、肥胖者、孕產婦和有慢性基礎疾病者等高危人群，也可發生在一般人群。
[0006]接種流感疫苗可有效預防相應亞型/系的流感病毒感染，降低發生嚴重并發癥的風險；通常接種流感疫苗2
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4周后，可產生具有保護水平的抗體，6
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8月后抗體滴度開始衰減。
[0007]根據疫苗種類，流感病毒疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗兩大類，根據價數流感病毒疫苗有三價(H1N1、H3N2、B/Victoria)和四價(H1N1、H3N2、B/Victoria、B/Yamagata)。
[0008]目前，我國批簽發的流感疫苗品種主要為四價滅活/裂解疫苗、三價滅活/裂解疫
苗和三價減毒活疫苗三個產品類別。這類疫苗進行病毒滅活后提取HA為主的抗原作為疫苗，存在產量有限，受益人群少，免疫原性低等問題，影響了流感疫苗的接受度和推廣，因此開發高效廣譜的重組疫苗是流感疫苗的重要研發方向。

技術實現思路

[0009]本專利技術人通過研究發現，HA
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Fc作為抗原具有有效的中和抗體誘導能力，多拷貝串聯M2胞外區(M2e)作為抗原可以誘導具有廣譜作用性質的體液免疫和細胞免疫。將HA抗原、M2抗原及具有增效作用的Fc標簽共同串聯表達，則可以同時利用三種元件的免疫作用。其中，M2上有T/B細胞表位的情況下，能夠有效誘導中和抗體產生。但其作為短肽表位本身的抗體誘導能力通常較低，中和抗體效價較低，在實踐中短肽作為抗原需要連接載體才能有效誘導抗體生產。M2胞外區(M2e)表位與HA連接后，HA既可以發揮HA作為抗原的作用，又可以發揮作為M2載體的作用，提高M2作為抗原的誘導能力。M2的序列保守性是有限的，串聯多個不同M2可以涵蓋更多種毒株，提高對流感毒株變異的不敏感度。
[0010]因此，本專利技術提供一種流感病毒疫苗融合蛋白，其由流感HA抗原基因編碼的HA抗原片段與M2胞外區片段串聯后與人免疫球蛋白基因編碼的Fc片段串聯而成的融合蛋白。
[0011]優選地，HA抗原片段的C端連接M2胞外區片段，M2胞外區片段的C端再連接Fc片段。
[0012]更具體地，所述流感HA抗原基因選自甲型流感H1N1、H3N2亞型、及乙型victoria和Yamagata系的使人致病流感毒株。
[0013]更優選地，HA抗原基因來源于流感毒株的HA基因，例如毒株A/Beijing/24/2019(H1N1)對應GenBank編號:MN853429.1；優選地，選用其第1
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2012堿基序列的點突變型R344T編碼蛋白，例如其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0014]進一步優選地，M2胞外區片段是指其M2的N端2
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23氨基酸序列，優選地串聯2
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6個M2胞外區片段，例如2、3、4、5或6個；優選地，所述2
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6個M2胞外區片段來源于不同或相同的M2，例如分別來源于QID40717，QFR17397，QFR17408，QFR17284，QDW80887，所述M2胞外區片段的一個例子中其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0015]在一個具體實施方式中，HA抗原片段、M2胞外區片段、Fc片段之間可以有，也可以沒有連接片段。
[0016]另外優選地，Fc片段來源于人IgG1，所述Fc片段的一個例子中其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0017]本專利技術提供編碼所述的流感病毒疫苗融合蛋白的核酸、表達載體和重組宿主細胞，優選地所述宿主細胞為HEK293FT細胞、MDCK細胞、VERO細胞、CHO
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K1Q細胞、HEK293FT細胞或其它人體細胞。
[0018]本專利技術還提供所述的流感病毒疫苗融合蛋白為活性成分的流感疫苗，任選地還包括佐劑或藥學上可接受的輔料。
[0019]本專利技術進一步提供所述的流感病毒疫苗融合蛋白或所述的流感疫苗在制備預防或治療流感的藥物中的應用。
[0020]本專利技術的有益效果：HA是結合宿主受體的膜蛋白，其誘發的部分抗體結合HA后可以防止病毒與受體結合，起到防止病毒入侵的作用，是有效的誘導中和抗體的抗原。M2的序列保守性賦予了它誘導的免疫反應具有廣譜的結合病毒的作用，但M2的序列短，且中和抗
體誘導能力弱，單獨的M2抗原起到的作用效力有限。本專利技術的蛋白抗原結合了有效的關鍵的中和抗體免疫原HA和廣譜型免疫原M2e，可以兼顧預防主要流行毒株和次本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種流感病毒疫苗融合蛋白，其由流感HA抗原基因編碼的HA抗原片段與M2胞外區片段串聯后與人免疫球蛋白基因編碼的Fc片段串聯而成的融合蛋白。2.如權利要求1所述的流感病毒疫苗融合蛋白，其特征在于，HA抗原片段的C端連接M2胞外區片段，M2胞外區片段的C端再連接Fc片段。3.如權利要求1所述的流感病毒疫苗融合蛋白，其特征在于，所述流感HA抗原基因選自甲型流感H1N1、H3N2亞型、及乙型Victoria和Yamagata系的使人致病流感毒株。4.如權利要求1所述的流感病毒疫苗融合蛋白，其特征在于，HA抗原基因來源于流感毒株的HA基因，例如毒株A/Beijing/24/2019(H1N1)對應GenBank編號: MN853429.1；優選地，選用其第1
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2012堿基序列的點突變型R344T編碼蛋白，例如其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。5.如權利要求1所述的流感病毒疫苗融合蛋白，其特征在于，M2胞外區片段是指其M2的N端2
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23氨基酸序列，優選地串聯2
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6個M2胞外區片段，例如2、...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李杰，王麗英，王艷，伍樹明，常文翔，舒展，銀飛，張海江，劉永江，
申請(專利權)人：北京康樂衛士生物技術股份有限公司，
類型：發明
國別省市：