一種口腔黏膜細胞的培養方法技術

本發明專利技術公開了一種口腔黏膜細胞的培養方法，屬于細胞培養技術領域，旨在解決現有技術中的口腔黏膜培養方法，細胞容易出現老化，細胞貼壁及增殖能力均明顯減弱，無法達到組織工程的需要的問題。通過獲取和處理口腔黏膜細胞組織標本、利用胰酶對標本進行分組消化分離、對黏膜細胞進行體外原代培養和傳代培養，提高了口腔黏膜細胞的分離純度，細胞不容易出現老化，使口腔黏膜細胞在一定時間內保持增殖能力，提高了口腔黏膜細胞的貼壁及增殖能力，同時應用DispaseII分離的無血清培養技術，短期內能夠獲得更多數量且活力高的口腔黏膜細胞，可初步滿足組織工程化黏膜培養需求。可初步滿足組織工程化黏膜培養需求。

【技術實現步驟摘要】
一種口腔黏膜細胞的培養方法


[0001]本專利技術涉及細胞培養
，具體為一種口腔黏膜細胞的培養方法。

技術介紹

[0002]口腔里的細胞都是有著同樣的形態，功能，統稱為口腔細胞。口腔細胞有牙髓細胞、牙周膜細胞、唾液腺細胞、口腔黏膜細胞、破骨細胞、成骨細胞、軟骨細胞、口腔腫瘤細胞等等。但一般所謂的口腔細胞指的是口腔表皮細胞。各個細胞產生時很相似，經過分化，形態、結構產生差異。
[0003]口腔黏膜上皮細胞主要指的是排列密集的上皮細胞結構。口腔黏膜細胞大多數是扁平多邊形的，分布在口腔兩側頰黏膜處，口腔黏膜上皮細胞屬于口腔黏膜一部分，表面看起來明顯角化或者是不全角化。口腔黏膜上皮細胞有一定的作用，主要是起到了耐摩擦的效果，可以避免異物入侵，如果上皮細胞缺少容易出現口腔疾病。在上皮的垂直切面上，口腔黏膜細胞形狀不一，緊靠基膜的一層基底細胞為矮柱狀，為具有增殖分化能力的干細胞，部分子細胞向淺層移動，基底層以上是數層多邊形細胞，再上為幾層梭形或扁平細胞，僅靠近表面幾層細胞為扁平狀，基底層細胞能不斷分裂增生，以補充表層衰老或損傷脫落的細胞，復層扁平上皮深層的結締組織內有豐富的毛細血管，有利于復層扁平上皮的營養。
[0004]細胞培養是指在體外模擬體內環境(無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養條件等)，使之生存、生長、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術，在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。不論對于整個生物工程技術，還是其中之一的生物克隆技術來說，細胞培養都是一個必不可少的過程，細胞培養本身就是細胞的大規模克隆。細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術必不可少的環節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。細胞培養技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術，通過細胞培養既可以獲得大量細胞，又可以借此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。細胞培養需要的環境因素有：無菌環境、合適的溫度、適宜的滲透壓、理想的氣體環境和PH。細胞培養的一般過程包括：準備工作、取材、培養、冷凍及復蘇。
[0005]口腔粘膜上皮細胞的體外培養具有重要的生物學及臨床意義。它不僅為研究口腔粘膜分化、口腔病理生理、毒理學及癌發生機理等提供良好的實驗體系，也對人類組織工程化口腔粘膜構建和口腔粘膜組織缺損修復具有重要意義，同時對于眼瞼、喉、氣管及尿道等粘膜缺損的修復重建有重要臨床意義。構建組織工程化尿道需要足夠數量的種子細胞，人們嘗試利用口腔黏膜細胞作為種子細胞，而種子細胞的增殖能力和純度與細胞分離的效果密切相關。
[0006]現有技術中的口腔黏膜培養方法，細胞容易出現老化，細胞貼壁及增殖能力均明顯減弱，無法達到組織工程的需要。

技術實現思路

[0007]鑒于現有技術中所存在的問題，本專利技術公開了一種口腔黏膜細胞的培養方法，采用的技術方案是，包括以下步驟：S1：口腔黏膜細胞標本的獲取和處理：無菌條件下收集年齡10～50歲健康人口腔修復手術中切除的口腔黏膜，將所收集到的黏膜置于培養基中，用D
?
Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血跡，并用鑷子去除黏附的結締組織等非培養所需組織，再用緩沖液浸泡5～8分鐘，盡量去除黏膜下組織，再用手術刀將黏膜組織切成0.3cm～1cm大小的若干組織塊，靜置片刻后，用吸管吸去上層液體，加入適當的緩沖液再清洗一次；S2：口腔黏膜細胞標本的分組：每個標本分成相等兩份，其中一份放入2.5g/L的消化酶溶液，放置于4℃冰箱消化16～18小時；另一份則置2.5g/L的胰酶，放置于4℃冰箱16～18小時，兩組分離時間相同；S3：消化分離：用鑷子將表皮撕下，將兩組的上皮分別用2.5g/L的胰酶37℃震蕩消化5～10分鐘，加入混合消化液終止消化，用吸管吹打成單細胞液，用D
?
Hanks液洗滌兩次，加入培養液，以差速貼壁法排除成纖維細胞；S4：原代培養：臺盼藍染色，血細胞計數板計數活細胞，細胞懸液接種密度為2.5x104個/cm，接種于預涂膠原的24孔培養板中，置于細胞培養箱中靜置培養，當原代培養細胞可以黏附于瓶壁，并伸展開始生長時，可補加原培養液量1/2的新培養液，第5天首次換液，以后每2～3天換液1次，一般7～14天可以長滿瓶壁，進行傳代；S5：傳代培養：傳代培養細胞生長、增殖至80％～90％融合時傳代，吸去或倒掉培養瓶內舊培養液，再向瓶內加人混合消化液，以能覆蓋培養瓶底為宜，37℃消化，再將培養瓶放在相差顯微鏡下進行觀察，當發現胞質回縮，細胞間隙增大后立即終止消化，吸出消化液，向瓶內加入D
?
Hanks液輕輕轉動培養瓶，重復2～3次把殘留的消化液沖掉，然后再加入培養液，使用彎頭吸管，吸取瓶內培養液，按順序反復吹打瓶壁細胞，使瓶壁細胞從瓶壁脫離形成單細胞懸液，用計數板計數后，以1:3或1:4分別接種于新的培養瓶中，置于CO2培養箱中進行培養，2～3天后換一次生長液，待細胞鋪滿器皿底面，即可使用，也可繼續傳代擴大培養或換成維持液。
[0008]作為本專利技術的一種優選技術方案，所述步驟S1中的緩沖液為2.5g/L洗必泰液。
[0009]作為本專利技術的一種優選技術方案，所述步驟S1中的培養基是分數為10％血清的DMEM。
[0010]作為本專利技術的一種優選技術方案，所述步驟S2中的消化酶為DispaseII溶液，所述胰酶為胰酶
?
EDTA。
[0011]作為本專利技術的一種優選技術方案，所述步驟S3中的混合消化液為0.125％胰蛋白酶：0.02％EDTA＝1:1，所述培養液為DMEM:F12＝3:1，加10％胎牛血清。
[0012]作為本專利技術的一種優選技術方案，所述步驟S4中細胞培養箱內部溫濕度條件為：37℃、5％CO2飽和濕度。
[0013]作為本專利技術的一種優選技術方案，所述步驟S4中的靜置培養時長一般3～5天。
[0014]作為本專利技術的一種優選技術方案，所述步驟S5中消化時長為3～5分鐘。
[0015]本專利技術的有益效果：本專利技術通過獲取和處理口腔黏膜細胞組織標本、利用胰酶對標本進行分組消化分離、對黏膜細胞進行體外原代培養和傳代培養，提高了口腔黏膜細胞
的分離純度，細胞不容易出現老化，使口腔黏膜細胞在一定時間內保持增殖能力，提高了口腔黏膜細胞的貼壁及增殖能力，同時應用DispaseII分離的無血清培養技術，短期內能夠獲得更多數量且活力高的口腔黏膜細胞，可初步滿足組織工程化黏膜培養需求。
具體實施方式
[0016]實施例1
[0017]本專利技術公開了一種口腔黏膜細胞的培養方法，采用的技術方案是，包括以下步驟：S1：口腔黏膜細胞標本的獲取和處理：無菌條件下收集年齡10歲健康人口腔修復手術中切除的口腔黏膜，將所收集到的黏膜置于分數為10％血清的DMEM中，用D
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Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血跡，并用鑷子去除黏附的結締組織等非培養所需組織，再用2.5g/L洗必泰液浸泡5分鐘，盡量去除黏膜下組織，本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種口腔黏膜細胞的培養方法，其特征在于：包括以下步驟：S1：口腔黏膜細胞標本的獲取和處理：無菌條件下收集年齡10～50歲健康人口腔修復手術中切除的口腔黏膜，將所收集到的黏膜置于培養基中，用D
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Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血跡，并用鑷子去除黏附的結締組織等非培養所需組織，再用緩沖液浸泡5～8分鐘，盡量去除黏膜下組織，再用手術刀將黏膜組織切成0.3cm～1cm大小的若干組織塊，靜置片刻后，用吸管吸去上層液體，加入適當的緩沖液再清洗一次；S2：口腔黏膜細胞標本的分組：每個標本分成相等兩份，其中一份放入2.5g/L的消化酶溶液，放置于4℃冰箱消化16～18小時；另一份則置2.5g/L的胰酶，放置于4℃冰箱16～18小時，兩組分離時間相同；S3：消化分離：用鑷子將表皮撕下，將兩組的上皮分別用2.5g/L的胰酶37℃震蕩消化5～10分鐘，加入混合消化液終止消化，用吸管吹打成單細胞液，用D
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Hanks液洗滌兩次，加入培養液，以差速貼壁法排除成纖維細胞；S4：原代培養：臺盼藍染色，血細胞計數板計數活細胞，細胞懸液接種密度為2.5x104個/cm，接種于預涂膠原的24孔培養板中，置于細胞培養箱中靜置培養，當原代培養細胞可以黏附于瓶壁，并伸展開始生長時，可補加原培養液量1/2的新培養液，第5天首次換液，以后每2～3天換液1次，一般7～14天可以長滿瓶壁，進行傳代；S5：傳代培養：傳代培養細胞生長、增殖至80％～90％融合時傳代，吸去或倒掉培養瓶內舊培養液，再向瓶內加人混合消化液，以能覆蓋培養瓶底為宜，37℃消化，再將培養瓶放在相...

【專利技術屬性】
技術研發人員：宋偉，
申請(專利權)人：大連思芙雅生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：