MagLOCI復合微球及其應用制造技術

本發(fā)明專利技術公開了一種MagLOCI復合微球及其應用。本發(fā)明專利技術公開了一種基于光激化學發(fā)光的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括磁性復合微球，即MagLOCI復合微球；其中，所述磁性復合微球包括主體磁性微球和共價連接在所述主體磁性微球表面的客體納米微球，所述客體納米微球用于產(chǎn)生單線態(tài)氧或將單線態(tài)氧的能量轉換為熒光。本發(fā)明專利技術能夠彌補現(xiàn)有LOCI技術的不足，拓展LOCI的應用領域。相比于傳統(tǒng)LOCI技術MagLOCI技術是一種更高性能、通用、靈活的光激化學發(fā)光檢測平臺。平臺。平臺。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
MagLOCI復合微球及其應用


[0001]本專利技術屬于生物檢測領域，具體涉及一種MagLOCI復合微球及其應用。

技術介紹

[0002]免疫診斷已取代生化診斷成為我國體外診斷行業(yè)中市場規(guī)模最大的細分領域。其中化學發(fā)光由于出色的靈敏度、動態(tài)范圍、全自動操作流程以及高通量測試速度等優(yōu)點，逐漸成為了目前免疫分析技術的主流。在歐美發(fā)達國家，化學發(fā)光免疫分析技術已經(jīng)基本取代酶聯(lián)免疫分析，占免疫診斷90％以上市場份額。2021年，我國化學發(fā)光占比約84％，市場規(guī)模達到284億元。
[0003]根據(jù)免疫反應狀態(tài)可將化學發(fā)光技術分為非均相化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)以及均相化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。前者是目前的主流化學發(fā)光系統(tǒng)，主要包括酶促化學發(fā)光技術、直接化學發(fā)光技術以及電化學發(fā)光技術。傳統(tǒng)的非均相化學發(fā)光平臺需要多次重復的洗滌步驟來徹底消除游離的標記分子對本底信號的影響，但多次洗滌會導致樣品中的微球損失率不可控，多次洗滌不僅會增加檢測時間，更會產(chǎn)生較大的結果誤差，影響檢測精密度。均相化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)在檢測過程中無需分離系統(tǒng)，其代表技術為光激化學發(fā)光技術。光激化學發(fā)光技術又稱發(fā)光氧通道免疫分析(Luminescent oxygen channeling immunoassay,LOCI)技術，在1994由Ullman EF等人[Proc.Natl.Acad.Sci.U S A1994,91,5426.]專利技術，后由PerkinElmer公司以及西門子公司開發(fā)為商業(yè)產(chǎn)品。LOCI檢測系統(tǒng)由供體球(DB)和受體球(AB)組成。其中，DB球內摻雜光敏劑，受光激發(fā)后能產(chǎn)生單線態(tài)氧；AB球內摻雜二甲基噻吩和鑭系金屬配合物，二甲基噻吩將單線態(tài)氧的能量轉換成360nm發(fā)射光，激發(fā)鑭系金屬配合物產(chǎn)生熒光。在受到680nm激光照射后，DB能激活周圍環(huán)境中的氧轉化為單線態(tài)氧，其生存時間僅為4微秒。短暫的生存時間決定了離子氧的傳播直徑很小(約為200nm)。當待測分子存在時，其與偶聯(lián)捕獲抗體的AB和偶聯(lián)檢測抗體的DB通過雙抗夾心作用形成免疫復合物。此時AB與DB間距小于200nm，AB接受DB產(chǎn)生的單線態(tài)氧而被激發(fā)出615nm的光信號。而當沒有待測分子存在時，AB與DB間距較遠而無法激發(fā)出AB的光信號。
[0004]PerkinElmer公司推出了一項AlphaPlexTM系統(tǒng)[公開(告)號：US8486719]，利用在AB球內摻雜不同發(fā)射波長(615nm、545nm、645nm)的鑭系金屬配合物用于檢測不同的待測分子，實現(xiàn)多重檢測。由于檢測需要加入三種檢測抗體，三種AB球，此外血清/血漿樣本基質成分復雜，因此多重檢測存在干擾的風險大大增加。同時在一個測試孔中優(yōu)化三種指標的檢測性能難度以及成本大大增加。
[0005]LOCI技術具有免洗、背景低、靈敏度高、重復性好且操作簡單耗時短的優(yōu)點。雖然近年來基于LOCI技的光激化學發(fā)光市場規(guī)模保持快速增長，但是其占整個化學發(fā)光市場比例很小。這可能是由于現(xiàn)有LOCI技術由于其無法洗滌的特點，導致其在一些特定的場合表現(xiàn)不佳(基質效應問題嚴重，間接法檢測抗體指標性能較差，hook效應嚴重等情況)，進而限制了其更加廣泛的應用。因此，光激化學發(fā)光市場的增長空間較大。
[0006]為了解決LOCI技術由于不能洗滌導致的基質影響問題，科美診斷的專利[專利號：
CN109709317B]使用了親和素修飾的磁珠來達到分離基質的效果。但是該方法是在磁珠和AB形成免疫復合物后，再加入DB在結合了免疫復合物和AB的親和素微球剩余的位點上進行標記，其標記效率受空間位阻效應以及有限的生物素
?
親和素位點的影響，效果不是很理想。
[0007]現(xiàn)有的LOCI技術仍然具有幾個方面的缺點，將限制其臨床應用范圍，主要有以下幾個方面：
[0008]1、檢測性能受樣本基質影響：1)間接法檢測抗體的性能較差。通過免疫分析檢測抗體的方式包含間接法、雙抗原夾心法、競爭法、中和法等方法。雙抗原夾心方法受空間位阻限制，所使用的抗原分子量不能過大，因此可檢測的指標受限。競爭法適用于小分子或只有一個抗原表位的指標，其測試結果的可靠性受競爭抗體的特異性和親和力大小的影響。雙抗原夾心或競爭法對包被在固相載體上的抗原或競爭抗體的要求較高，且不能區(qū)分待檢抗體免疫球蛋白的類別，如IgG和IgM的區(qū)分。經(jīng)典間接法一般有兩步反應，第一步將包被在固相載體上的已知抗原包與待檢抗體結合，第二步標記抗抗體(第二抗體)與待檢抗體結合。間接法可通過抗抗體區(qū)分待檢抗體的免疫球蛋白類別，即可判斷近期感染(IgM指標)，又可檢測人群抗體(免疫力)水平(IgG指標)，對判斷感染性疾病的病程有重要價值。但是在間接法兩步反應之間需洗滌去除非特異性抗體，否則非特異性抗體將會與第二抗體結合造成假陰性結果，或者非特異性吸附在固相載體表面，造成假陽性結果。因此現(xiàn)有LOCI技術不適合使用間接法簡單、定量檢測抗體。2)無法檢測特殊樣本、檢測臨床樣本靈敏度不高。雖然LOCI技術中無需分離洗滌步驟，但是受基質效應的影響，血清和血漿樣本中常常因含有內源性的干擾蛋白質導致免疫分析結果出現(xiàn)假陽性、假陰性的結果，例如補體、溶菌酶、纖維蛋白、自身抗體、類風濕因子，異嗜性抗體等產(chǎn)生干擾的物質。此外，LOCI技術也無法準確檢測含有生物素的樣本。生物素即維生素B7，正常人血漿中生物素的濃度約為0.12
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0.36nmol/L，當人體攝入大劑量生物素后，血液中的游離生物素及其代謝產(chǎn)物濃度可達正常濃度數(shù)百至數(shù)千倍。含有生物素的血清/血漿樣本會導致結合供體球表面的鏈霉親和素，使檢測信號降低產(chǎn)生假陰性結果。為了解決生物素的干擾，科美診斷申請的專利[專利號：CN111122844A]中使用表面修飾親和素的多孔微球作為抗干擾劑，通過將微球與含生物素的樣本共同孵育來達到消除生物素分子的功能。但是該抗干擾劑的制備過程繁瑣，同時需要額外的孵育流程來消除生物素分子，可行性不高。
[0009]2、存在Hook效應
[0010]由于游離的待測抗原或者抗體一直存在于反應系統(tǒng)中，LOCI的Hook效應嚴重，導致無法直接檢測高濃度待測樣本，線性范圍窄。對此，博陽生物的一篇專利CN108204959B中，通過對比待測樣本兩次讀取信號的差值的增幅來判斷該樣本是否存在Hook效應，但其未從根本上解決Hook效應的問題。

技術實現(xiàn)思路

[0011]本專利技術的所要解決的技術問題是為了克服現(xiàn)有LOCI技術由于其無法洗滌的特點，導致其在一些特定的場合表現(xiàn)不佳(基質效應問題嚴重、無法通過間接法檢測抗體指標、hook效應嚴重等)的缺陷，提供一種MagLOCI復合微球及其應用。本專利技術通過引入受體微球和磁性微球復合物，使MagLOCI平臺賦予LOCI技術洗滌的功能，能夠彌補現(xiàn)有LOCI技術的不
足，拓展LOCI的應用領域。相比于傳統(tǒng)LOCI技術MagLOCI技術是一種更高性能、通用、靈活的光激化學發(fā)光檢測平臺。
[0012]本專利技術通過以下技術方案解決上述技術問題。
[0013]本專利技術的本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種基于光激化學發(fā)光的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括磁性復合微球；其中，所述磁性復合微球包括主體磁性微球和共價連接在所述主體磁性微球表面的客體納米微球，所述客體納米微球用于產(chǎn)生單線態(tài)氧或將單線態(tài)氧的能量轉換為熒光。2.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述主體磁性微球或客體納米微球的表面具有含氨基、羧基或醛基的單體或其聚合物的修飾；和/或，所述磁性復合微球的磁含量為4～75wt.％；較佳地，所述主體磁性微球或客體納米微球的表面具有含氨基或其聚合物的修飾，相應地所述客體納米微球或主體磁性微球的表面具有含羧基或醛基的單體或其聚合物的修飾；和/或，所述含氨基、羧基或醛基的單體或其聚合物的密度至少為100μmol/mg客體納米微球或主體磁性微球；和/或，所述磁性復合微球的磁含量為5～50wt.％；更佳地，所述主體磁性微球的表面具有含氨基或其聚合物的修飾，所述客體納米微球的表面具有含羧基或醛基的單體或其聚合物的修飾；和/或，所述含氨基的聚合物為聚乙烯亞胺；和/或，所述磁性復合微球的磁含量為10～30wt.％。3.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述客體納米微球的表面偶聯(lián)生物捕獲分子，所述生物捕獲分子用于結合待測分子；較佳地，所述生物捕獲分子為抗體分子或抗原分子。4.如權利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒還包括匹配微球，當所述客體納米微球產(chǎn)生單線態(tài)氧時，所述匹配微球用于將單線態(tài)氧的能量轉換為熒光；當所述客體納米微球用于將單線態(tài)氧的能量轉換為熒光時，所述匹配微球用于產(chǎn)生單線態(tài)氧；較佳地，所述檢測試劑盒還包括生物檢測分子，所述生物檢測分子用于結合待測分子，并且所述生物檢測分子和所述生物捕獲分子結合所述待測分子的不同位點；其中，所述生物檢測分子與所述匹配微球特異性結合。5.如權利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于，產(chǎn)生單線態(tài)氧的所述匹配微球或客體納米微球包含光敏劑，所述光敏劑在接收到激發(fā)光后產(chǎn)生單線態(tài)氧；轉換所述單線態(tài)氧的能量的客體納米微球或匹配微球包含二甲基噻吩和鑭系金屬配合物，所述二甲基噻吩將單線態(tài)氧的能量轉換為發(fā)射光，并通過鑭系金屬配合物產(chǎn)生熒光；和/或，所述生物檢測分子與所述匹配微球通過生物素
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親和素系統(tǒng)特異性結合；較佳地，所述生物檢測分子或待測分子為生物素修飾的生物檢測分子或待測分子，所述匹配微球為鏈霉親和素...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：馮祖瑩，
申請(專利權)人：上海羧菲生物醫(yī)藥科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：