一種新的載脂蛋白Ａ－Ⅱ的制備制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及重組蛋白質(zhì)及其生產(chǎn)、純化、鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達重組人載脂蛋白Ａ－ＩＩ（ｒｈＡｐｏＡ－ＩＩ），以及優(yōu)化的高密度發(fā)酵生產(chǎn)和純化重組人載脂蛋白Ａ－ＩＩ的方法。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及重組蛋白質(zhì)及其制備，特別是涉及在巴斯德酵母中表達重組人載脂蛋 白A-II (rhApoA-II)，以及優(yōu)化的高密度發(fā)酵生產(chǎn)重組人載脂蛋白A-II的方法。
技術(shù)介紹
載脂蛋白A-lKapolipoprotein A-II, ApoA-II)由肝臟和小腸合成，人血漿中的 ApoA-II半衰期為4. 4天，是血清高密度脂蛋白(HDL)中第二種主要的載脂蛋白，約占HDL 中蛋白總量的20%。在乳靡微粒(CM)中它的含量可達總載脂蛋白的7% 10%，極低密度 脂蛋白(VLDL)中也有少量的ApoA-II存在，血漿中ApoA-II的濃度為0. 35 0. 5g/L(羅 靜聰，劉秉文，藍天鶴.人血漿載脂蛋白A-II的分離純化及鑒定.生物化學雜志，1990， 6(2) 157-161)。ApoA-II是由兩條各含77個氨基酸的肽鏈組成，單體分子量為8700D，在人血漿中 以二聚體形式存在，在不加還原劑的SDS-PAGE中測出相對分子質(zhì)量約為17. 5kD。ApoA-II 有多態(tài)性存在，最主要的多態(tài)性等電點為4.9。人ApoA-II mRNA長473個堿基，含有一個 58bp的5’不翻譯區(qū)。人類和鼠的ApoA-II定位于1號染色體上。其基因結(jié)構(gòu)與ApoA_I、 A-IV、C-II、C-III及E的基因結(jié)構(gòu)頗為相似，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。內(nèi)含子I長 169bp，插入基因組5’不翻譯區(qū)；內(nèi)含子II長293bp，插入緊鄰信號肽基因酶切位點的密碼 區(qū)；內(nèi)含子III插入成熟肽的編碼區(qū)。ApoA-II具有多種生理功能①維持HDL結(jié)構(gòu)=ApoA-II肽段12 31和肽段50 77具有與磷脂的結(jié)合能力，經(jīng)二級結(jié)構(gòu)分析認為，殘基17 30和51 62形成的雙性螺 旋結(jié)構(gòu)是人ApoA-II與脂質(zhì)結(jié)合的分子基礎(chǔ)；②激活肝脂酶(h印atic lipase，HL)，用以水 解CM和VLDL中的三酰甘油和磷脂；③抑制凝血酶原活性；④抑制卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移 酶(LCAT)活性，從而阻礙細胞內(nèi)膽固醇的運出，酯化和轉(zhuǎn)移；⑤其他=ApoA-II還具有置換 HDL顆粒中的ApoA-I，識別HDL受體、結(jié)合脂蛋白和部分拮抗低密度脂蛋白對內(nèi)皮細胞的損 傷作用，從而保持內(nèi)皮細胞膜的完整性等功能。ApoA-II的多種生物學活性使其在脂質(zhì)代謝調(diào)控中起著十分重要的作用。現(xiàn)階 段，對ApoA-II的檢測多限于試驗研究，對某些疾病的診斷或研究起到輔助作用。目前， ApoA-II多是從血漿中分離并純化得到的，成本高而產(chǎn)量低。因此，有必要建立和發(fā)展重組 表達和純化ApoA-II的方法，以便滿足實驗室研究的需求。甲基營養(yǎng)酵母，特別是巴斯德畢赤酵母是已被深入研究的真核表達系統(tǒng)，并已被 用于表達許多有用的蛋白質(zhì)。例如，美國專利5，324，639公開了在甲基營養(yǎng)酵母特別是巴 斯德畢赤酵母細胞中生產(chǎn)胰島素樣生長因子1的方法；美國專利5，330，901公開了使用 巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)表達人血清白蛋白的方法；美國專利5，965，389提供了在甲基營養(yǎng) 酵母中表達L-谷氨酸脫羧酶(GAD65)的DNA構(gòu)建體以及由之制備純的GAD65的方法；美 國專利公開了在巴斯德畢赤酵母中表達血小板衍生的細胞因子(PDGF)的方法；美國專利 6，780，615描述了使用重組巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)應(yīng)樂果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未見關(guān) 于使用巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)人載脂蛋白A-II的報道。3專利技術(shù)目的本專利技術(shù)的一個目的是提供一種使用甲基營養(yǎng)酵母生產(chǎn)重組人載脂蛋白 A-II(rhApoA-II)多肽的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲基營 養(yǎng)酵母，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是用包括下列可操作連接的元件的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的 (1)甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動子；(2)編碼載脂蛋白A-II的DNA片段；(3)轉(zhuǎn)錄終止子和(4) 可選擇標志，從而以至少50mg/L培養(yǎng)基的濃度產(chǎn)生載脂蛋白A-II多肽。根據(jù)本專利技術(shù)的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母， 并且所說的甲基可誘導(dǎo)的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。本專利技術(shù)的另一個目的是提供用于表達重組人載脂蛋白A-II的甲基營養(yǎng)酵母，該 酵母能夠依靠作為碳源和能源的甲醇生長，并且是被包括甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動子、編碼 載脂蛋白A-II的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標志的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的。根據(jù)本專利技術(shù)的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母， 并且甲基可誘導(dǎo)的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。本專利技術(shù)的再一個目的是提供用于在巴斯德畢赤酵母中表達重組人載脂蛋白A-II 多肽的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括可操作地連接的元件甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動子、編碼載 脂蛋白A-II的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標志。根據(jù)本專利技術(shù)的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母， 并且所說的甲基可誘導(dǎo)的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。本專利技術(shù)的再一個目的是提供使用巴斯德畢赤酵母大規(guī)模生產(chǎn)重組人載脂蛋白 A-II多肽的優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)條件，特征在于其中發(fā)酵溫度維持在28°C 30°C，所使用的pH 值為6. 0 6. 5，并且培養(yǎng)基中添加有0. 5% (W/V)的蛋白胨。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)涉及蛋白質(zhì)生產(chǎn)、純化和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達載脂 蛋白A-II的方法。巴斯德畢赤酵母(P. Pastoris)是20世紀80_90年代發(fā)展起來的極具潛力的酵母 表達系統(tǒng)，由于其在蛋白質(zhì)表達方面具有其它系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)點而得到越來越廣泛的應(yīng)用。作為真核表達系統(tǒng)，巴斯德畢赤酵母具有許多其它蛋白表達系統(tǒng)所不具備的優(yōu) 點①屬于單細胞生物，故保留了易于操作和生長速度快的特點；②營養(yǎng)要求低，培養(yǎng)基成 分簡單，生產(chǎn)成本低，特別適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；③通過同源重組，可將表達載體穩(wěn)定 地整合到宿主染色體中，連續(xù)傳代中不易丟失；④具有強有力的乙醇氧化酶基因(AOX)啟 動子，可嚴格調(diào)控外源基因的表達；⑤表達量高，許多蛋白的產(chǎn)率可達到每升克以上水平； ⑥表達的蛋白質(zhì)既可存在于胞內(nèi)又可分泌至胞外，巴斯德畢赤酵母自身蛋白質(zhì)的分泌量很 低，十分有利于目的產(chǎn)物純化；⑦作為真核表達系統(tǒng)，可對表達的蛋白進行翻譯后的正確加 工和修飾；⑧糖基化程度低。畢赤酵母表達系統(tǒng)由一個外源基因表達框和AOXl啟動子、多克隆位點(MCS)和 一個從AOXl基因上拷貝下來的終止序列(TT)組成。同時，大多數(shù)載體都包含作為篩選標 記的HIS4基因和為拷貝增殖而存在的序列(如ColEI復(fù)制起始點和抗氨芐青霉素基因)。替代或插入方式整合到染色體的AOXl部位的A0X13’非編碼 區(qū)序列。本專利技術(shù)所使用的載體是由啟動子、終止子、選擇標記、報告基因、復(fù)制起點等元件構(gòu) 成。另外分泌型載體還需要有信號序列。最常用的啟動子是AOXl啟動子，它的甲醇誘導(dǎo)性很強，因而它控制下的外源基因 能得到較高的表達。細胞中絕大多數(shù)乙醇氧化酶活力是由AOXl提供的。當在以葡萄糖或 甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長時，AOXl轉(zhuǎn)錄受到抑制；而在以甲醇為唯一生長碳源時，則可 誘導(dǎo)AOXl基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達。選擇標記(HIS4) —般是對應(yīng)于營養(yǎng)缺陷型受體的野 生型基因。巴本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種使用甲基營養(yǎng)酵母生產(chǎn)重組人載脂蛋白Ａ－Ⅱ多肽的方法，該方法包括：在以甲醇為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲基營養(yǎng)酵母，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是用包括下列可操作連接的元件的ＤＮＡ構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的：（１）甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動子；（２）編碼人載脂蛋白Ａ－Ⅱ的ＤＮＡ片段；（３）轉(zhuǎn)錄終止子和（４）可選擇標志，從而以至少５０ｍｇ／Ｌ培養(yǎng)基的濃度得到重組人載脂蛋白Ａ－Ⅱ多肽。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：顏煒群，蘇曼曼，
申請(專利權(quán))人：吉林圣元科技有限責任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：82[中國|長春]