本發明專利技術提供一種伊枯草菌素A抗菌脂肽及其制備方法，方法包括采用以豆粕為基質，通過優化固態培養基發酵產生抗菌脂肽，采用水提及酸沉淀、兩步超濾法純化，得到高純度組分。通過優化豆粕固體發酵的培養基及發酵條件，使優化后的發酵培養基產的抗菌脂肽含量達到782.36 mg/kg，為優化前純豆粕固體發酵的3.2倍，抗菌脂肽對惡臭假單胞菌的抑菌率能夠從優化前的64.21%提高到90.01%。本發明專利技術的發酵底物成本低廉，固態發酵設備簡單，單位發酵基質濃度高，生產能耗低，同時兩步超濾法降低了純化成本。得到的高純度脂肽為未曾報道過新的伊枯草菌素A，能夠有效抑制惡臭假單胞菌，在水產養殖業及人類臨床等的疾病防治方面具有廣闊的應用前景。景。景。
【技術實現步驟摘要】
一種伊枯草菌素A抗菌脂肽及其制備方法
[0001]本專利技術涉及生物活性肽
，具體為一種伊枯草菌素A抗菌脂肽及其制備方法。
技術介紹
[0002]芽孢桿菌屬（Bacillus）是一類兼性厭氧或好氧的革蘭氏陽性桿菌，能夠產生不同結構的多肽類抗菌物質，是工業化生產抗菌脂肽的常用菌株之一。抗菌脂肽的分子結構由疏水性脂肪酸鏈及親水性肽鏈構成，其氨基酸可與烴鏈上的羥基或氨基以酰胺鍵或內酯結合形成環狀結構。抗菌脂肽的抗菌活性及表面活性劑的性質，使其在醫藥、農業、石油開發等方面具備巨大開發潛力。目前研究及應用較多的脂肽主要是伊枯草菌素（iturin）、表面活性素（surfactin）、及豐原素（fengycin）這三大家族。其中Iturin可使細菌或真菌的細胞膜上形成小孔，改變細胞膜的滲透性，同時可與甾醇形成iturin/磷脂復合物或iturin/甾醇發揮抑菌作用。Iturin主要有Iturin A，C，D，E，其中Iturin A應用最為廣泛。Iturin A具有高的抑菌活性、表面活性及溶血作用，其抗菌譜廣、毒性低及致敏反應低。
[0003]脂肽具有表面活性強、抑菌效果好、易被生物降解、環境友好等特點，并且其穩定性好，酸堿耐高溫，符合目前生物替抗產業要求及綠色環保發展理念。目前液態發酵為制備脂肽的主要發酵方式，但液態發酵成本高，設備要求及造價高，同時發酵過程中因為脂肽的表面活性特性會出現起泡及跑料的問題。固態發酵設備簡單，單位發酵基質濃度高，生產能耗低。且固態發酵后產物的提取工藝簡單、生產用水及提取溶劑使用量少。目前已有研究證明，以小麥麩皮、啤酒糟或者大豆渣料作為底物進行固態發酵，其抗菌脂肽產量要高于液態發酵。因此，以低廉原料為發酵基質的固態發酵制備抗菌脂肽的方式具有的巨大的開發潛力。
技術實現思路
[0004]本專利技術目的在于提供一種伊枯草菌素A抗菌脂肽及其制備方法，能夠有效抑制惡臭假單胞菌，在水產養殖業及人類臨床等的疾病防治方面具有廣闊的應用前景。
[0005]為達成上述目的，本專利技術提出如下技術方案：一種伊枯草菌素A抗菌脂肽，伊枯草菌素A抗菌脂肽的肽結構為：。
[0006]伊枯草菌素A抗菌脂肽的氨基酸序列為：β
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NH
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fatty acid
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Asp
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Tyr
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Asn
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Pro
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Ser
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Asn
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Pro。
[0007]一種伊枯草菌素A抗菌脂肽的制備方法，包括以下步驟：步驟1：將保藏號為CGMCC No. 19541的枯草芽孢桿菌N
?
2 接入豆粕半固態培養基富集得到菌液，以菌液混合豆粕和營養因子制成的固體發酵培養物進行發酵，獲得發酵產物； 其中，保藏號為CGMCC No. 19541的枯草芽孢桿菌N
?
2在公開號為CN111713607A的專利中已經公開，其菌株命名為枯草芽孢桿菌(拉丁學名Bacillus subtilisN
?
2)，其保藏編號為CGMCCNo.19541，保藏日期為2020年3月30日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
[0008]步驟2：將發酵產物離心，采用水提及酸沉淀法提取抗菌脂肽；步驟3：采用兩步法超濾進行脂肽的分離純化，并利用反相高效液相色譜法進行測定，得到伊枯草菌素A抗菌脂肽。
[0009]優選的，步驟1中所述豆粕半固態發酵培養基為：豆粕、LB培養基，LB培養基包括10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物和5 g/L 氯化鈉，其中豆粕和LB培養基的料液比5:1
?
10:1，對培養基在121℃下滅菌20 min，接種量0.5%，溫度27
?
38℃，時間6
?
12 h，獲得菌液；所述固體發酵培養物包括菌液5
?
10%、豆粕、水、葡萄糖1
?
2%、谷氨酸鈉0.8
?
1.8%、脯氨酸0.5
?
1.5%、天冬氨酸0.5
?
1.5%、KCl 0.1
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0.25%、(NH4)2SO40.1
?
0.25%、Na2HPO40.05
?
0.2 %，溫度 27
?
38℃，時間24
?
60h，其中豆粕和水的料液比5:1
?
10:1。
[0010]優選的，步驟2中水提及酸沉淀的過程為：發酵結束后，按照發酵底物：蒸餾水= 1:8
?
1:10（w/v）加入蒸餾水，室溫攪拌1
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2 h后靜置30
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60 min，4000 r/min離心20
?
30 min后除去不溶物，上清用5 mol/L鹽酸調節pH至2.0
?
2.5，4℃ 靜置6 h后，4000 r/min低溫離心20
?
30 min獲得沉淀，沉淀用甲醇按照1∶6(w/v)復溶，萃取4 h后旋轉蒸發除去甲醇獲得脂肽提取物。
[0011]優選的，所述步驟3中兩步法超濾過程為：將步驟2中獲得的脂肽提取物用超純水按照 1:5
?
1:12 (w/v) 復溶, 并用0.22μm微孔濾膜過濾去除雜質，濾過液使用分子量10 kDa超濾膜截留大分子物質，大分子物質包括脂肽膠束，截留物使用蒸餾水復溶，并加入等體積甲醇，用NaOH調節pH至6.0
?
7.0后低溫攪拌1.5
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3 h，隨后用分子量10 kDa超濾膜收集分子量小于10 kDa的濾過液，再用凍干后即為純化脂肽粉。
[0012]優選的，所述步驟3中反相高效液相色譜測定的過程為：制備型液相柱，Agilent Zorbax SB
?
Aq C18；流動相含0.1 %甲酸的乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）；洗脫模式，30% A （0 min）— 45% A （10 min）— 55% A （20min）—55% A （35 min）；流速5 mL/min，柱溫30
?°
C，檢測波長210 nm，本專利技術所得伊枯草菌素A抗菌脂肽粉中伊枯草菌素純度大于70%。
[0013]有益效果，本申請的技術方案具備如下技術效果：1、本專利技術以枯草芽孢桿菌N
?
2 （CGMCC No. 19541）為脂肽生產菌株，通過優化發酵培養基及發酵條件，使優化后的發酵培養基產的抗菌脂肽與純豆粕發酵培養相比，含量達到782.36mg/kg，為優化前的3.2倍。同時，優化后的抗菌脂肽對惡臭假單胞菌的抑菌率能夠從優化前的64.21%提高到90.01%，顯示出良好的抑菌活性。
[0014]2、本研究提供了兩步法超濾，極大減少了脂肽純化成本，得到了具有新的氨基酸結構的伊本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種伊枯草菌素A抗菌脂肽，其特征在于：伊枯草菌素A抗菌脂肽的肽結構為：。2.一種伊枯草菌素A抗菌脂肽的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：步驟1：將保藏號為CGMCC No. 19541的枯草芽孢桿菌N
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2 接入豆粕半固態培養基富集得到菌液，以菌液混合豆粕和營養因子制成的固體發酵培養物進行發酵，獲得發酵產物；步驟2：將發酵產物離心，采用水提及酸沉淀法提取抗菌脂肽；步驟3：采用兩步法超濾進行脂肽的分離純化，并利用反相高效液相色譜法進行測定，得到伊枯草菌素A抗菌脂肽。3.根據權利要求2所述的一種伊枯草菌素A抗菌脂肽的制備方法，其特征在于：步驟1中所述豆粕半固態發酵培養基為：豆粕、LB培養基，LB培養基包括10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物和5 g/L 氯化鈉，其中豆粕和LB培養基的料液比5:1
?
10:1，對培養基在121℃下滅菌20 min，接種量0.5%，溫度27
?
38℃，時間6
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12 h，獲得菌液；所述固體發酵培養物包括菌液5
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10%、豆粕、水、葡萄糖1
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2%、谷氨酸鈉0.8
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1.8%、脯氨酸0.5
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1.5%、天冬氨酸0.5
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1.5%、KCl 0.1
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0.25%、(NH4)2SO
4 0.1
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0.25%、Na2HPO
4 0.05
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0.2 %，溫度 27
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38℃，時間24
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60 h，其中豆粕和水的料液比5:1
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10:1。4.根據權利要求3所述的一種伊枯草菌素A抗菌脂肽的制備方法，其特征在于：步驟2中水提及酸沉淀...
【專利技術屬性】
技術研發人員：牟海津，任昕淼，付曉丹，李萌，
申請(專利權)人：南京益纖生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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