一種指壓式無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)微流控芯片及其檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種指壓式無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)的微流控芯片，包括流道層、薄膜層和指壓層，流道層包含檢測(cè)腔室、樣本儲(chǔ)液池、反應(yīng)液儲(chǔ)液池、蛇形流道、氣閥，其中反應(yīng)液儲(chǔ)液池中包含基于CRISPR

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種指壓式無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)微流控芯片及其檢測(cè)方法


[0001]本專利技術(shù)涉及微流控技術(shù)以及分子診斷領(lǐng)域，具體屬于一種指壓式無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)微流控芯片及其檢測(cè)方法。
技術(shù)背景
[0002]傳統(tǒng)核酸檢測(cè)的過(guò)程，第一步是樣本采集以及核酸純化。樣本可以是血液、尿液、唾液等體液，采集后需進(jìn)行預(yù)處理裂解細(xì)胞使得細(xì)胞破碎，釋放出細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA等物質(zhì)。而細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)等物質(zhì)會(huì)對(duì)后續(xù)的擴(kuò)增有一定的影響，需要通過(guò)一些手段如磁珠法、濃鹽法等去除雜質(zhì)純化核酸。第二步是核酸擴(kuò)增，該過(guò)程中最常用的技術(shù)即是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，通過(guò)解鏈、退火、延伸三步增多特定目的片段，放大檢測(cè)信號(hào)。擴(kuò)增之后使用熒光檢測(cè)、比色或者濁度檢測(cè)等方法進(jìn)行核酸檢測(cè)。
[0003]以上過(guò)程較為復(fù)雜，用時(shí)較長(zhǎng)，并且在核酸檢測(cè)過(guò)程需要專業(yè)人員進(jìn)行復(fù)雜的操作。對(duì)于一些偏遠(yuǎn)及基層醫(yī)院環(huán)境設(shè)備較為局限的地區(qū)，使用傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方式較為困難，檢測(cè)效率亟待提高。而微流控技術(shù)是將化學(xué)生物等一些流體實(shí)驗(yàn)集中縮小至微米尺度中操作的一種技術(shù)。近年來(lái)，微流控技術(shù)融合多個(gè)領(lǐng)域快速發(fā)展，并得到廣泛的應(yīng)用。
[0004]基于CRISPR的核酸檢測(cè)，如SHERLOCK和DETECTR，作為快速和敏感的方法，最近一直吸引著人們的熱切關(guān)注。這些基于CRISPR的方法包括目標(biāo)核酸的預(yù)擴(kuò)增過(guò)程和隨后由CRISPR
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Cas酶介導(dǎo)的檢測(cè)，如Cas12a或Cas13a通過(guò)熒光或比色讀出。然而，預(yù)擴(kuò)增過(guò)程增加了檢測(cè)時(shí)間(至少幾十分鐘)，并可能由于擴(kuò)增錯(cuò)誤而造成假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。目前已有用于核酸檢測(cè)的微流控芯片，中國(guó)專利“申請(qǐng)?zhí)枺?02210955530.6”提出了一種集等溫?cái)U(kuò)增和CRISPR
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cas系統(tǒng)一體的用于核酸檢測(cè)的微流控芯片及檢測(cè)方法，該種方式需要外源提供離心力，無(wú)法實(shí)現(xiàn)便攜，且需要對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，步驟較為繁瑣。中國(guó)專利“申請(qǐng)?zhí)枺?02011131328.9”提出一種指壓式的用于核酸檢測(cè)的微流控芯片，該芯片核酸純化步驟復(fù)雜，且擴(kuò)增需要外源提供65℃高溫，不利用制備成便攜的檢測(cè)設(shè)備。為克服這些挑戰(zhàn)，本專利技術(shù)將CRISPR
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Cas13的核酸檢測(cè)系統(tǒng)和微流控芯片結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種無(wú)擴(kuò)增的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0005]本專利技術(shù)基于微流控技術(shù)開(kāi)發(fā)了一款指壓式無(wú)擴(kuò)增的核酸檢測(cè)微流控芯片
[0006]本專利技術(shù)的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0007]一種指壓式無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)微流控芯片，其特征在于，所述芯片結(jié)構(gòu)包括流道層、薄膜層和指壓層；所述芯片采用層壓的技術(shù)進(jìn)行封合；所述芯片是基于CRISPR
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cas13a系統(tǒng)的無(wú)擴(kuò)增熒光檢測(cè)方法進(jìn)行核酸檢測(cè)。
[0008]根據(jù)權(quán)利要求1所述的指壓式無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)微流控芯片，其特征在于，所述芯片包含檢測(cè)腔室、樣本儲(chǔ)液池、反應(yīng)液儲(chǔ)液池、蛇形流道、氣閥；其中，反應(yīng)液儲(chǔ)液池中含有基于CRISPR
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cas13a的無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)體系，該無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)體系包含無(wú)引物復(fù)水緩沖液、轉(zhuǎn)錄優(yōu)化5X緩沖液、rNTP、T7聚合酶、Rnase抑制劑、熒光Reporter、CrRNA以及CRISPR
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Cas13a溶液。
[0009]權(quán)利要求2所述的檢測(cè)腔室，其特征在于，樣本液與CRISPR
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cas13a無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)體系在檢測(cè)腔室中混合，完成檢測(cè)；所述腔室的溫度通過(guò)接觸外部的恒溫控制板來(lái)維持37℃的反應(yīng)條件，通過(guò)將芯片置于熒光檢測(cè)平臺(tái)中，實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化來(lái)反映循環(huán)擴(kuò)增情況。
[0010]權(quán)利要求2所述的樣本儲(chǔ)液池和反應(yīng)液儲(chǔ)液池，其特征在于，樣本儲(chǔ)液池和反應(yīng)液儲(chǔ)液池中的液體通過(guò)指壓的方式使氣閥開(kāi)閉，從而控制流體定向流入檢測(cè)腔室；當(dāng)按下指壓閥門時(shí)，氣體向兩側(cè)流動(dòng)，推動(dòng)流體向檢測(cè)腔室流動(dòng)，當(dāng)放開(kāi)指壓閥門時(shí)，氣體向兩側(cè)流動(dòng)，推動(dòng)儲(chǔ)液池中的流體向檢測(cè)腔室的方向流動(dòng)，通過(guò)反復(fù)操作指壓閥門可控制液體定量流動(dòng)。
[0011]根據(jù)權(quán)利要求1所述的指壓式無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)微流控芯片，其特征在于，其核酸檢測(cè)方法包括以下步驟：
[0012](a)使用移液槍向樣本液儲(chǔ)液池中加入20
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30μL裂解后的樣本液，向反應(yīng)液儲(chǔ)液池中加入40
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50μL反應(yīng)液混合液，反應(yīng)液混合液包括16.13
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26.13μL無(wú)引物復(fù)水緩沖液、10μL轉(zhuǎn)錄優(yōu)化5X緩沖液、5μL rNTP、1μL T7聚合酶、1μL Rnase抑制劑、1μL熒光Reporter、1μL質(zhì)粒溶液、0.12μL CrRNA以及0.45μLCRISPR
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Cas13a溶液；
[0013](b)按下指壓樣本儲(chǔ)液池的閥門使得樣本液流至檢測(cè)腔室；
[0014](c)按下指壓反應(yīng)液儲(chǔ)液池的閥門使得反應(yīng)液流至檢測(cè)腔室；
[0015](d)控制核酸恒溫檢測(cè)單元的溫度為37
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42℃，在顯微鏡下觀測(cè)反應(yīng)物的熒光強(qiáng)度，并定量分析核酸濃度。
[0016]根據(jù)權(quán)利要求1所述的指壓式無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)的微流控芯片，其特征在于，所述指壓層和流道層的材料不限于采用聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、丙烯腈
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丁二烯
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苯乙烯共聚物(ABS)，指壓層和流道層采用注塑成型方式；注塑成型為，預(yù)先加工出模具，然后將聚丙烯(PP)材料在220
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280℃的恒溫料筒中融化，然后加壓140
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800MPa將融化后的PP材料注入模具，之后保壓、冷卻成型；芯片中核酸提取單元使用機(jī)加工的方式，在核酸提取腔室加工一定形狀的微陣列，經(jīng)過(guò)表面處理之后可達(dá)到吸附核酸的作用；薄膜層的材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)，可通過(guò)等離子處理后與其他材料鍵合。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0018]本專利技術(shù)將實(shí)時(shí)熒光核酸檢測(cè)實(shí)現(xiàn)在微流控芯片上，簡(jiǎn)化了繁瑣的人為操作；同時(shí)，本專利技術(shù)基于CRISPR
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cas13a系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)無(wú)擴(kuò)增檢測(cè)，簡(jiǎn)化了預(yù)擴(kuò)增的步驟；該設(shè)備實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)實(shí)驗(yàn)從試管到芯片、從手動(dòng)到自動(dòng)、從復(fù)雜到簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)變；本專利技術(shù)中使用手指按壓驅(qū)動(dòng)的方式實(shí)現(xiàn)流體的順序釋放，提供一種便攜式無(wú)需借助外部設(shè)備的驅(qū)動(dòng)方式，該種驅(qū)動(dòng)方式可以擺脫儀器與環(huán)境的束縛，可隨時(shí)隨地進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)，本專利技術(shù)中指壓驅(qū)動(dòng)方式每次按壓驅(qū)動(dòng)量與圓形腔室的大小有關(guān)，可實(shí)現(xiàn)定量泵送。
附圖說(shuō)明
[0019]圖1為指壓式的無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0020]圖2為流道層(1)的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0021]圖3為指壓層(3)的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0022]圖4為樣本液氣閥與反應(yīng)液氣閥的工作原理示意圖。
具體實(shí)施方式
[0023]以下對(duì)本專利技術(shù)的實(shí)施方式做詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，下述說(shuō)明僅僅是示例性的，而不是為了限制本專利技術(shù)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種指壓式無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)微流控芯片，其特征在于，所述芯片結(jié)構(gòu)包括流道層、薄膜層和指壓層；所述芯片采用層壓的技術(shù)進(jìn)行封合；所述芯片是基于CRISPR
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cas13a系統(tǒng)的無(wú)擴(kuò)增熒光檢測(cè)方法進(jìn)行核酸檢測(cè)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的指壓式無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)微流控芯片，其特征在于，所述芯片包含檢測(cè)腔室、樣本儲(chǔ)液池、反應(yīng)液儲(chǔ)液池、蛇形流道、氣閥；其中，反應(yīng)液儲(chǔ)液池中含有基于CRISPR
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cas13a的無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)體系，該無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)體系包含無(wú)引物復(fù)水緩沖液、轉(zhuǎn)錄優(yōu)化5X緩沖液、rNTP、T7聚合酶、Rnase抑制劑、熒光Reporter、CrRNA以及CRISPR
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Cas13a溶液。3.權(quán)利要求2所述的檢測(cè)腔室，其特征在于，樣本液與CRISPR
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cas13a無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)體系在檢測(cè)腔室中混合，完成檢測(cè)；所述腔室的溫度通過(guò)接觸外部的恒溫控制板來(lái)維持37℃的反應(yīng)條件，通過(guò)將芯片置于熒光檢測(cè)平臺(tái)中，實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化來(lái)反映循環(huán)擴(kuò)增情況。4.權(quán)利要求2所述的樣本儲(chǔ)液池和反應(yīng)液儲(chǔ)液池，其特征在于，樣本儲(chǔ)液池和反應(yīng)液儲(chǔ)液池中的液體通過(guò)指壓的方式使氣閥開(kāi)閉，從而控制流體定向流入檢測(cè)腔室；當(dāng)按下指壓閥門時(shí)，氣體向兩側(cè)流動(dòng)，推動(dòng)流體向檢測(cè)腔室流動(dòng)，當(dāng)放開(kāi)指壓閥門時(shí)，氣體向兩側(cè)流動(dòng)，推動(dòng)儲(chǔ)液池中的流體向檢測(cè)腔室的方向流動(dòng)，通過(guò)反復(fù)操作指壓閥門可控制液體定量流動(dòng)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的指壓式無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)微流控芯片，其特征在于，其核酸檢測(cè)方法包括以下步驟：(a)使用移液槍向樣本液儲(chǔ)液池中加入20
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30μ...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：邢佑強(qiáng)，武文濤，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：武文濤，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：