一種花藥絨氈層和花粉特異性高效啟動子及其應用制造技術

本發明專利技術提供了花粉和花藥絨氈層特異性啟動子，其核苷酸序列如序列表ＳＥＱ?。桑摹。危铮彼?。該啟動子序列是通過對玉米基因組文庫篩選，從玉米基因組中克隆得到的，其能驅動目的基因在花藥絨氈層和花粉中具有特異性表達。本發明專利技術包括利用該啟動子序列來創造雄性不育的植物基因工程方法，更具體的說，將所述啟動子下游銜接異源或同源基因，并構建植物表達載體，轉化宿主植物，該啟動子序列能夠驅動其下游基因在其花藥絨氈層和花粉中高效特異表達目的蛋白，實現創造植物雄性不育，或者改造轉基因植物的安全性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，具體地說，涉及一種從玉米中分離到的花藥絨氈層和花粉特異性高效啟動子序列及其應用。從玉米基因組DNA中 克隆得到的上述花藥絨氈層和花粉特異性啟動子，并與不同的同源、異源 基因連接構建植物表達載體，轉化宿主植物，使轉基因植株劃分高效特異 表達其下游基因的方法和應用。
技術介紹
轉基因植物研究與開發的過程中發現，外源基因表達的時間，空間和 表達量，往往是造成無法得到理想的轉基因植物和有效的研究基因作用機 理的重要因素。轉錄水平的調控是植物基因表達調控的最重要的調控方式 在。啟動子的驅動活性和特性直接決定了基因表達的時空特性以及表達量 的多少。因此，對植物啟動子的克隆和功能分析非常重要。雜種優勢作為一種提高作物產量，改善作物品質，提高作物抗蟲、抗 病、抗逆的手段已被廣泛的應用，并取得令人矚目的成就，以植物雄性不 育為基礎的雜種優勢利用已成為許多作物的育種目標，在農業生產上發揮 巨大的作用。但自然出現的雄性不育類型很少存在著周期長，不育基因來 源單一等問題，而且恢復系的培育和后代的篩選上也存在著一定的不足。而利用基因工程創造雄性不育的策略為雜種優勢的利用克服了上述缺陷。 主要利用花粉或花藥特異表達啟動子，驅動目標基因在花粉中特異表達， 獲得雄性不育植株。例如Mariani等利用煙草花藥絨氈層特異啟動子 TA29將核糖核酸基因導入煙草，結果核糖核酸酶特異表達能夠選擇性地 破壞與花粉發育相關的一些器官或組織，阻斷花粉發育進程，導致植物雄 性不育。 Paul等利用擬南芥花藥絨站層 特異性啟動子A9特異表達核糖核酸酶基因同樣獲得了雄性不育煙草植 株。Hird等將與抗病性相關的P-l，3葡聚糖酶基因分別與擬南芥花粉發育 早期啟動子A9，A3融合，轉化矮牽牛后獲得不同程度的雄性不育植株 。目前對花藥特異基因的轉錄調控還知之甚少，花藥特異啟動子的獲得 有助于深入理解花藥和花粉發育。玉米中已經獲得的花藥特異基因有10 余個，大多數是花粉特異，同時在花粉和花藥中表達的基因很少。
技術實現思路
本專利技術目的之一是提供一種花藥絨氈層和花粉特異表達啟動子序列， 來自于玉米基因組DNA，在植物花藥絨氈層和花粉中特異表達。本專利技術的另 一 目的是提供一種驅動同、異源基因在花藥絨氈層和花粉 中高效特異表達的新方法。本專利技術通過利用花藥特異的cDNA片段，篩選玉米基因組文庫，得到 的核苷酸序列，稱之為pZmW7，長度為1971bp,為雙鏈核酸類型，其序 列如序列表SEQIDNo.l所示。通過三大數據庫的檢索，未發現有相同或 相似性較高的序列。生物信息學分析pZm^7序列，發現其具備真核啟動 子的基本元件(TATA box和CAAT box)和花藥特異表達的相關順式元 件(GC box， NTP303 Q element, LAT52 Q element)。本專利技術還提供了含有上述啟動子的重組表達載體。所述啟動子的下游 可連接結構基因、調節基因、結構基因的反義基因、調節基因的反義基因 或者能夠干擾內源基因表達的小RNA,用于驅動結構基因、調節基因、 結構基因的反義基因、調節基因的反義基因、天然小RNA或人工合成的小RNA的表達。所述重組表達載體為植物重組表達載體。在一個優選的實施方式中，其表達盒是由/ Zm4W啟動子和GUS (卩-葡糖醛酸酶基因)報告基因及來自胭脂堿合成酶(nos)基因的轉錄終止區域構成，選擇標記基因為新霉素磷酸轉移酶II (NPTII),所述的表達載體優選的是重組質粒pZm401::GUS。本專利技術將上述含有所述； Zm4W啟動子序列的重組表達載體轉化宿主細胞或宿主組織及其后代細胞，獲得外源基因在花藥絨氈層和花粉中高效驅動表達的基因工程化宿主細胞或宿主組織及其后代細胞。在一個優選的實施方式中，將含有所述pZm4W啟動子序列驅動的表達載體轉化煙草，獲得了 GUS基因在花藥和絨氈層中高效驅動表達的轉基因植物。本專利技術所述的植物宿主細胞或宿主組織可以是植物花藥絨氈層和花 粉細胞或植物藥絨氈層和花粉細胞本身，或它們的后代，蛋白質等組成成 分或花藥和絨氈層特性已經改變的植物花藥和絨氈層細胞或植物花藥和 絨氈層本身。本專利技術所述的植物組織中表達花藥和絨氈層特異性啟動子的方法，包 括下述步驟(1) 將含有本專利技術啟動子的植物表達載體導入植物細胞；(2) 使所述的植物細胞生長成能夠結種子的成熟植物。 本專利技術中所述的核酸序列還可以是還可以是所述核苷酸序列與其他啟動子融合序列。本專利技術中所述的其他外源基因是指任何一段核酸序列，并具有編碼某 種蛋白質或其他活性物質功能，包括RNA或DNA序列，該序列與種子 特異性啟動子正常情況不相結合。此核酸序列包括不同于啟動子植物種類 的異源核酸序列，以及從相同于啟動子植物種類得到的同源核酸序列，但 這些序列與野生型(非轉基因)植物的啟動子無關。本專利技術中所述的表達載體是指現有技術中已知的、能夠在植物中進行 表達的任何一種載體，如pBI121等。本專利技術中所述的轉化技術是指已知的、能夠將外源基因導入植物細胞 或植物組織的任何一種植物轉化方法，如農桿菌介導法等。本專利技術中所述的宿主細胞或宿主組織及后代細胞是指所有植物細胞或 植物組織或由這些細胞或組織發育成熟的整株植株(包括種子)。術語"核酸序列"指含有天然存在的堿基，糖和糖之間(支鏈)的鍵的核苷 酸或核苷酸單體的序列。該序列也包括含有發揮相似功能的非天然存在的 單體或其部分被修飾或取代的序列。術語"花藥絨氈層和花粉特異性啟動子"是指在啟動子控制下表達的基 因在有或沒有基本表達的植物花藥的絨氈層和花粉中優先表達。本專利技術找到了玉米花藥絨氈層和花粉特異高效表達啟動子序列，并對 這一啟動子的花藥絨氈層和花粉高效特異活性進行了功能驗證。將所述的 啟動子序列連接異源或同源基因后，轉化到植物中可使異源或同源基因在 植物花藥絨氈層和花粉中高效特異表達，避免了目的基因在其他部位持續 表達所帶的不利影響。本專利技術提供了 一種利用所述核苷酸序列驅動目的基 因在植物花藥絨氈層和花粉中高效特異表達的新方法，在植物的遺傳改 良，雄性不育的創造和轉基因生物安全性研究方面具有重大的應用前景。附圖說明圖1顯示的是來源于玉米的花藥絨氈層和花粉特異表達啟動子序列pZm4W的相關啟動子元件。圖2顯示的是由/7Zm4W驅動的植物表達載體的構建過程。圖3顯示的是植物表達載體Zm401::GUS的酶切和PCR鑒定圖，其 中泳道1~4依次為Sacl， i^I+Jftal，五coRI, Wal的酶切電泳，6為PCR 產物(1535f/r), 5 & 7為X/歷"din+五coR I 。圖4顯示的是不同時期的再生煙草，其中A&B抗性芽形成，C、D&E 煙草植株再生，F轉化煙草植株開花。圖5顯示的是部分轉基因煙草植株的PCR檢測結果，A: Zm^W啟動 子的PCR檢測，B:g^基因的PCR檢測，2&17:陽性對照，3&16:陰性對照(wildtype), 1 & 18: X/歷mffll+五coR I ,其他為不同轉化植株。圖6顯示的是部分轉啟動子報告基因融合載體轉基因煙草的Southern 雜交檢測，其中1-5:不同轉化植株楊蓓，6:野生型，7:質粒對照，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種花粉和花藥絨氈層特異性啟動子，其特征在于，所述啟動子的核苷酸序列如ＳＥＱ?。桑摹。危铮彼尽?

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：于靜娟，敖光明，趙倩，劉俊起，李成霞，王冬雪，
申請(專利權)人：中國農業大學，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]