本發明專利技術涉及利用CRISPR/Cas9系統的褐變抑制馬鈴薯植株的制備方法，更具體地，涉及通過將包含靶向馬鈴薯來源的馬鈴薯多酚氧化酶2(Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2，StPPO2)基因的單向導RNA(sgRNA)的核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)復合物轉導至馬鈴薯原生質體來制備褐變得到抑制的基因組編輯馬鈴薯植株的方法。由于本發明專利技術的方法沒有外來基因的插入，只有與自然變異無法區分的微小變異，因此可與需要消耗巨大的成本及時間來評估安全性及是否具有環境危害性的轉基因生物(Genetically Modified Organism，GMO)作物不同，其有望節省成本及時間。其有望節省成本及時間。其有望節省成本及時間。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】利用CRISPR/Cas9系統的褐變抑制馬鈴薯植株的制備方法
[0001]本專利技術涉及一種利用CRISPR/Cas9系統的褐變抑制馬鈴薯植株的制備方法。
技術介紹
[0002]近來，消費者的食品購買方式轉向天然產品偏好及健康導向，同時，隨著單人家庭及核心家庭的增加，對具有新鮮度及便利性的輕度加工作物(minimally processed crops)的需求正在增加。由于這種輕度加工作物在生產階段中經過清洗、剝皮及切割等過程，因此消費者可在購買后無需經過預處理過程即可直接使用的優點。
[0003]馬鈴薯作為輕度加工作物之一，在加工過程中因剝皮及切割導致的表面暴露于空氣中及細胞壁破壞，容易發生酶促褐變現象(enzymatic browning)。
[0004]在包括馬鈴薯在內的植株中發生這種酶促褐變現象的主要原因是多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)蛋白，多酚氧化酶蛋白是一種含有Cu
2+
的酶，通過氧化細胞中存在的多酚化合物來轉化為左旋多巴(L
?
3,4
?
二羥基苯丙氨酸(L
?
3,4
?
dihydroxyphenylalanine)，L
?
DOPA)，左旋多巴轉化為多巴醌后，經氧化聚合反應引起形成深褐色黑色素的褐變現象。
[0005]眾所周知，這種褐變反應不僅使輕度加工作物呈現出令人不快的顏色及氣味，而且還會降低營養價值。并且，由于像這樣在輕度加工作物的儲存及流通過程中發生褐變的產品的商品性降低導致經濟損失，因此有必要抑制褐變。
[0006]最近的基因組編輯技術顯示了使用各種類型的位點特異性核酸酶(nuclease)在所需基因組DNA位置誘導基因突變的可能性。其中，CRISPR/Cas9系統作為與植物及其他許多有機體相關的強大的基因組編輯工具而周知。該系統的優點是精確有效地將突變引入靶位點。并且，表明基因編輯作物與通過現有傳統育種技術開發的作物相比沒有差異。
[0007]另一方面，日本公開專利第2019
?
507595號中公開了“一種顯示減少的損傷誘發性表面變色的植物”，韓國公開專利第2016
?
0087651號中公開了“一種防止褐變的有色馬鈴薯及防止有色馬鈴薯褐變的方法”，但沒有記載本專利技術的“一種利用CRISPR/Cas9系統的褐變抑制馬鈴薯植株的制備方法”。
技術實現思路
[0008]技術問題
[0009]本專利技術鑒于如上所述的要求而導出，本專利技術人為了抑制褐變，通過利用CRISPR系統代替普通的雜交育種或基因修飾方法來編輯馬鈴薯多酚氧化酶2基因，從體外培養的無菌馬鈴薯幼苗中分離原生質體之后，通過聚乙二醇(PEG)介導的轉染(transfection)方法引入核糖核蛋白(RNP)復合物(StPPO2sgRNA+Cas9)后，通過引入的原生質體的細胞再生及分化來最終選擇馬鈴薯多酚氧化酶2基因被編輯的個體，并且從選擇的基因編輯植株中選擇多酚氧化酶2(PPO2)蛋白活性及褐變現象得到抑制的馬鈴薯品系，從而完成了本專利技術。
[0010]技術方案
[0011]為了解決上述問題，本專利技術提供一種用于抑制馬鈴薯植株褐變的基因組編輯用組合物，其包含如下成分作為有效成分：對馬鈴薯來源的馬鈴薯來源的馬鈴薯多酚氧化酶2(Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2，StPPO2)基因的靶堿基序列具有特異性的向導RNA(guide RNA)和核酸內切酶(endonuclease)蛋白的復合物(ribonucleoprotein)；或者重組載體，包含編碼對馬鈴薯來源的馬鈴薯多酚氧化酶2基因的靶堿基序列具有特異性的向導RNA的DNA及編碼核酸內切酶蛋白的核酸序列。
[0012]并且，本專利技術提供一種向導核酸，其為在構成馬鈴薯多酚氧化酶2(Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2，StPPO2)基因的核苷酸序列中對靶區域具有特異性的RNA序列，上述靶區域為序列號5的堿基序列。
[0013]并且，本專利技術提供一種褐變得到抑制的基因組編輯馬鈴薯植株的制備方法，其包括：步驟(a)，通過將對馬鈴薯來源的馬鈴薯多酚氧化酶2基因的靶堿基序列具有特異性的向導RNA及核酸內切酶蛋白引入馬鈴薯植物細胞中來編輯基因組；以及步驟(b)，從上述基因組被編輯的馬鈴薯植物細胞再生馬鈴薯植株。
[0014]并且，本專利技術提供一種通過上述方法制備的褐變得到抑制的基因組編輯馬鈴薯植株及其基因組被編輯的種薯。
[0015]專利技術的效果
[0016]通過本專利技術的方法制備的褐變得到抑制的基因組編輯馬鈴薯植株，即使在預先切削或搗碎的情況下也可延緩褐變，便于加工或烹飪，減少額外工序，如用于抑制褐變的加熱及添加人工添加劑等。并且，由于本專利技術的方法沒有外來基因的插入，只有與自然變異無法區分的微小變異，因此可與需要消耗巨大的成本及時間來評估安全性及是否具有環境危害性的轉基因生物(Genetically Modified Organism，GMO)作物不同，其有望節省成本及時間。
附圖說明
[0017]圖1至圖4是為了驗證候選單向導RNA而進行的體內試驗(In vivo assay)的靶向深度測序(Target deep
?
sequencing)結果。
[0018]圖5示出從馬鈴薯幼植株的葉子中分離原生質體，(A)部分是VCP處理馬鈴薯幼植株的葉子的狀態，(B)部分是示出通過用蔗糖濃度梯度分離經VCP處理的原生質體來確認的完整(intact)的原生質體(紅色箭頭標記部分)的狀態，(C)部分是最終分離的原生質體的顯微鏡觀察照片。
[0019]圖6是從引入CRISPR/Cas9核糖核蛋白復合物的馬鈴薯原生質體再生的植株的狀態。
[0020]圖7至圖10是從引入CRISPR/Cas核糖核蛋白復合物的原生質體再生的植株中的部分個體的深度測序(deep
?
seq.)分析結果。
[0021]圖11是示出本專利技術的方法的馬鈴薯原生質體的馬鈴薯多酚氧化酶2編輯效率(左)及馬鈴薯原生質體來源的馬鈴薯多酚氧化酶2編輯物的插入缺失(InDel)模式(右)的結果。
[0022]圖12是使用馬鈴薯塊莖測定多酚氧化酶2(PPO2)蛋白活性的結果。
[0023]圖13是使用馬鈴薯塊莖觀察褐變現象的結果，(A)部分是將馬鈴薯的塊莖切片后比較對照區(WT)與基因編輯物(GE#14、#25)的狀態，(B)部分是將馬鈴薯塊莖僅去除表皮后
比較對照區(WT)與基因編輯物(GE#14、#25)的狀態。
具體實施方式
[0024]為了實現本專利技術的目的，本專利技術提供一種用于抑制馬鈴薯植株褐變的基因組編輯用組合物，其包含如下成分作為有效成分：對馬鈴薯來源的馬鈴薯多酚氧化酶2(Solanum tuberosum Polyp本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.一種用于抑制馬鈴薯植株褐變的基因組編輯用組合物，其特征在于，包含如下成分作為有效成分：對馬鈴薯來源的馬鈴薯多酚氧化酶2基因的靶堿基序列具有特異性的向導RNA和核酸內切酶蛋白的復合物；或者重組載體，包含編碼對馬鈴薯來源的馬鈴薯多酚氧化酶2基因的靶堿基序列具有特異性的向導RNA的DNA及編碼核酸內切酶蛋白的核酸序列。2.根據權利要求1所述的用于抑制馬鈴薯植株褐變的基因組編輯用組合物，其特征在于，上述馬鈴薯多酚氧化酶2基因的靶堿基序列由序列號5的堿基序列組成。3.一種向導核酸，其特征在于，上述向導核酸為在構成馬鈴薯多酚氧化酶2基因的核苷酸序列中對靶區域具有特異性的RNA序列，上述靶區域為序列號5的堿基序列。4.一種褐變得到抑制的基因組編輯馬鈴薯植株的制備方法，其特征在于，包括：步驟(a)，通過將對馬鈴薯來源的馬鈴薯多酚氧化酶2基因的靶堿基序列具有特異性的向導RNA及核酸內切酶蛋白引入馬鈴薯植物細胞中來編輯基因組；以及步驟(b)，從上述基因組被編輯的馬鈴薯植物細胞再生馬鈴薯植株。5.根據權利要求4所述的褐變得到抑制的基因組編輯馬鈴薯植株的制備方法，其特征在于，使用如下成分將上述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：權純一，韓智學，李叡琳，金芭琳，
申請(專利權)人：株式會社圖爾金，
類型：發明
國別省市：
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